幹細胞培養のためのマイクロキャリア

专利摘要:
本発明者らは、それにコートされたマトリックスを含み、陽電荷を有する粒子であって、それに付着した霊長類またはヒトの幹細胞の集合を可能にするサイズのものである粒子を開示する。この粒子は、５０μｍ〜４００μｍ、たとえば約２００μｍの最長寸法を有する、実質的に細長い、円筒形またはロッドの形状の粒子を含むことができる。それは２０μｍ〜３０μｍの断面寸法をもつことができる。粒子は、約２０μｍ〜約１２０μｍ、たとえば約６５μｍのサイズを有する、実質的にコンパクトな、または球形の形状の粒子を含むことができる。本発明者らは、霊長類またはヒトの幹細胞を伝播させる方法であって、第１および第２の各粒子に付着した第１および第２の霊長類またはヒトの幹細胞を用意し、第１の霊長類またはヒトの幹細胞を第２の霊長類またはヒトの幹細胞に接触させて細胞集合体を形成させ、そしてこの集合体を培養して霊長類またはヒトの幹細胞を少なくとも１継代伝播させることを含む方法をも開示する。Ｍａｔｒｉｇｅｌまたはヒアルロン酸中にコートしたマイクロキャリアを用いてヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）を長期懸濁培養において伝播させる方法も開示する。本発明者らは、幹細胞を分化させる方法をも開示する。
公开号:JP2011514169A
申请号:JP2011500744
申请日:2009-03-17
公开日:2011-05-06
发明作者:オー，スティーブ；チェン，アレン；チュー，アンドレ；ツヴァイゲルト，ロベルト；ルーヴェニー，ショール；レシナ，マルティ
申请人:エージェンシー フォー サイエンス，テクノロジー アンド リサーチ；
IPC主号:C12N5-071

专利说明:

[0001] 本発明は、細胞生物学、分子生物学およびバイオテクノロジーの分野に関する。より詳細には、本発明は幹細胞を粒子状キャリア上で培養する方法に関する。]
背景技術

[0002] 幹細胞は、分化した細胞と異なり、分裂して、自己再生する（ｓｅｌｆ−ｒｅｎｅｗ）か、または表現型および機能の異なる娘細胞に分化する能力をもつ(Keller, Genes Dev. 2005; 19: 1129-1155; Wobus and Boheler, Physiol Rev. 2005; 85: 635-678; Wiles, Methodsin Enzymology. 1993; 225: 900-918; Choi et al, Methods Mol Med. 2005; 105: 359-368)。]
[0003] ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）は、多様な幹細胞タイプに分化する能力をもつ多分化能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）細胞である。幹細胞、たとえば胚性幹細胞（ＥＳＣ）の多分化能、およびそれらが３種類すべての胚葉からの細胞に分化する能力により、これらは多くの疾患および組織傷害に対する再生医療に理想的な細胞源となる(Keller, Genes Dev. 2005; 19: 1129-1155; Wobus and Boheler, Physiol Rev. 2005; 85: 635-678)。]
[0004] １以上の継代を必要とする幹細胞の大量拡張は、細胞療法の前提条件である。
現在、コロニーとして増殖する幹細胞（ヒト胚性幹細胞ｈＥＳＣを含めて）は、通常はプラスチック培養表面において二次元（２Ｄ）成長で維持されている。２Ｄ培養においてより多量にまで拡張するには大きな表面積の使用が必要であろう。これらの２Ｄコロニーをより小さなサイズに分断するためのピペッティングまたは酵素処理の反復による細胞継代の手動性は、非実用的となるであろう。大きな表面積に接種するための多数のプレートの調製は、取扱い誤差の対象となる可能性がある。さらに、たとえばヌンク（Ｎｕｎｃ）トレーのような著しく大きな表面積が必要であろう。]
[0005] したがって、コートしたプラスチック表面で２Ｄコロニー培養として幹細胞を増殖させる現在の方法は、スケールアップになじまず、培養を実施する実験条件は一般に良好には制御しにくい。先行技術には、幹細胞を三次元（”３Ｄ”）環境で、たとえばマイクロキャリア上において懸濁培養で培養する多数の試みが含まれる。マイクロキャリア上のマウス胚性幹細胞(Fernandes et al., 2007; Abranches et al., 2007; King and Miller, 2007)およびｈＥＳＣを懸濁培養において胚様体（ｅｍｂｒｙｏｉｄ ｂｏｄｙ）として分化させるもの(Dang et al., 2004; Fok and Zandstra, 2005; Cameron et al., 2006)など幾つかの研究を除いて、ｈＥＳＣを懸濁培養において長期間、連続培養する強力な方法はない。]
[0006] 当技術分野で、胚性幹細胞を懸濁培養において”胚様体”として分化させることが知られている。そのような胚様体は多量の既に分化した細胞を含む。たとえばGerecht Nir et
al (2004)には、胚様体を培養するための回転壁バイオリアクターの使用が記載されている。撹拌システムを用いる胚様体培養も、Zandstra et al (2003), Dang et al (2004)およびWartenberg et al (1998)により示された。胚様体の懸濁培養も、Dang and Zandstra
(2005)およびKing and Miller (2007)により報告されている。そのような技術は、分化した幹細胞を含むこれらの組織様の胚様体集合体を培養するのには適しているが、未分化の幹細胞には適さない。]
[0007] Fok and Zandstra (2005)には、未分化のマウス胚性幹細胞（ｍＥＳＣ）の伝播のための撹拌懸濁培養システムが記載されている。この撹拌懸濁培養システムは、マイクロキャ
リアおよび集合体の培養からなっていた。ガラスマイクロキャリア上で培養されたマウス胚性幹細胞は、組織培養フラスコ対照に匹敵する集団倍増時間をもっていた。白血病阻害因子を除去すると、このｍＥＳＣ集合体は多系列分化しうる胚様体（ＥＢ）に発生した。マウスＥＳＣの懸濁培養は、King and Miller (2005)にも記載されている。しかし、King
and Miller (2005)には、”未分化のヒトＥＳＣｓ（ｈＥＳＣ）の拡張はｍＥＳＣの場合より難しく、まだ撹拌培養においては報告されていない”と述べられている。]
[0008] ＵＳ２００７／０２６４７１３（Ｔｅｒｓｔｅｇｇｅ）には、ヒト胚性幹細胞をマイクロキャリア上で培養する試みが開示されている。ヒト胚性幹細胞をＣｙｔｏｄｅｘ ３（Ａｍｅｒｓｈａｍ）マイクロキャリアと共に、種々の体積の馴化培地と一緒にスピナーまたはバイオリアクターに導入している。この培養物を２０〜３０ｒｐｍで１時間中の３０分間撹拌する。培養物を１０日ないし６週間の種々の期間、維持している。しかし、いずれの時点でも、培養物はいずれも、幹細胞の大規模連続生産に必須の要件である継代または二次培養がなされなかった。マイクロキャリア上での連続継代および二次培養能の証明は、’良好な’（指数）成長速度と共に、幹細胞の大規模生産に必須の要件である。これはＴｅｒｓｔｅｇｇｅらの研究により証明されなかった。]
[0009] ＷＯ２００８／００４９９０には、幹細胞をフィーダー細胞の不存在下で培養する試みが記載され、マイクロキャリアの使用を考慮している。それは、Ｍａｔｒｉｇｅｌを使用しない培養に関する。ＷＯ２００８／００４９９０には、幹細胞分化の阻害における陽電荷をもつ表面の影響が記載されている。]
[0010] Phillips et al., 2008 (Journal of Biotechnology 138 (2008) 24-32)には、ｈＥＳＣをマイクロキャリア上で集合体および単一細胞の接種により培養する試みが報告されている。最初は３倍拡張が５日間かけて達成されたが、各連続継代に伴って細胞拡張が低下し、最終的に６週目を超えて細胞を継代することはできなかった。]
[0011] 市販のマイクロキャリア、たとえばＣｙｔｏｄｅｘ １および３をヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）の培養のスケールアップのために使用するこれまでの試みは成功しなかった。ｈＥＳＣ培養物はキャリア上で死滅または分化し、伝播できなかった(Oh & Choo, 2006)。]
[0012] ヒト幹細胞を含めた霊長類に由来する未分化の多分化能性細胞の懸濁液中での安定な連続成長は、これまで達成されていない。霊長類またはヒトの幹細胞、特に胚性幹細胞の連続継代を、懸濁培養において証明した者はこれまでいない。]
[0013] 幹細胞を他の有用な細胞タイプに大規模で分化させることもきわめて重要である。たとえば、臨床試験、薬物探索を実施するためには、また有望な将来の細胞療法を開発するためにも、多数の心筋細胞が必要である。ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）は多分化能性であり、あらゆる胚葉に分化しうるので、ｈＥＳＣはこれらの用途のための心筋細胞および他の細胞タイプの供給源を提供することができる。これまで、ｈＥＳＣに由来する心筋細胞の分化プロトコルは科学社会でわずかに記載されているが、提唱された生物学的方法のスケール調節可能性（ｓｃａｌａｂｉｌｉｔｙ）は明らかではない。]
[0014] ＵＳ２００７／０２６４７１３
ＷＯ２００８／００４９９０]
先行技術

[0015] Keller, Genes Dev. 2005; 19: 1129-1155
Wobus and Boheler, Physiol Rev. 2005; 85: 635-678
Wiles, Methodsin Enzymology. 1993; 225: 900-918
Choi et al, Methods Mol Med. 2005; 105: 359-368
Fernandes et al., 2007
Abranches et al., 2007
King and Miller, 2007
Dang et al., 2004
Fok and Zandstra, 2005
Cameron et al., 2006
Gerecht Nir et al (2004)
Zandstra et al (2003)
Wartenberg et al (1998)
Dang and Zandstra (2005)
King and Miller (2005)
Phillips et al., 2008 (Journal of Biotechnology 138 (2008) 24-32)
Oh & Choo, 2006]
発明が解決しようとする課題

[0016] 本発明は、当技術分野におけるこれらおよび他の問題を解決することを目的とする。]
課題を解決するための手段

[0017] 本発明は、ヒトまたは霊長類の胚性幹細胞を安定に長期間、インビトロ培養において培養するための方法を提供する。この方法を用いて、ヒト胚性幹細胞を各継代間で連続拡張させることができ、拡張したヒト胚性幹細胞集団の多分化能性は少なくとも５継代を超えて、通常は１０継代を超えて維持される。]
[0018] 重要なことに、好ましくは細胞外マトリックス成分を含むマトリックスでマイクロキャリアをコートした場合、マイクロキャリア上での幹細胞の培養および分化を改善しうることを本発明者らは見いだした。マトリックスは、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ヒアルロン酸、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、コラーゲン、エラスチン、ヘパラン硫酸、デキストラン、デキストラン硫酸、コンドロイチン硫酸のうち１以上、またはラミニン、Ｉ型コラーゲン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、およびエンタクチン１の混合物を含むことができる。]
[0019] 幹細胞の成長および増殖のために好ましいマトリックスは、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）、ヒアルロン酸、ラミニンのうち１以上、またはラミニン、Ｉ型コラーゲン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、およびエンタクチン１の混合物を含むか、あるいはそれらからなることができる。]
[0020] 幹細胞の分化のために好ましいマトリックスは、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）のうち１以上、またはラミニン、Ｉ型コラーゲン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、およびエンタクチン１の混合物を含むか、あるいはそれらからなることができる。]
[0021] １観点において、本発明は、培養物中の幹細胞の多分化能性状態を維持しつつ、マイクロキャリア上で懸濁培養において幹細胞を多数継代にわたって成長および増殖させることに関する。好ましくは細胞外成分を含むマトリックス中にマイクロキャリアをコートし、そして幹細胞を接種する。好ましくは、マイクロキャリアは陽電荷をもつ。幹細胞を懸濁
培養において培養して、好ましくは培養物中の幹細胞の数を拡張させる。次いで、培養幹細胞を継代し、同一または異なるマトリックスコーティングをもつマイクロキャリア上に継代幹細胞を接種する。こうして、培養および継代した幹細胞が多分化能性状態を維持したまま、幹細胞は複数継代、たとえば少なくとも３継代を経ることができる。この方法を用いると、継代間の各培養サイクル期間中に幹細胞の増殖がみられ、多数（少なくとも１０）継代にわたって増殖を維持することができる。]
[0022] この培養方法により、インビトロ培養における幹細胞の連続した成長および継代が可能になり、これにより多分化能をもつ幹細胞を療法に有用な数まで拡張させるための方法が提供される。]
[0023] マイクロキャリア上での幹細胞の連続継代がしばしば好ましいであろうが、本発明方法の一部として、幹細胞をマイクロキャリア上での培養から他の培養システム、たとえば２Ｄコロニー培養へ移植し、続いて懸濁マイクロキャリア培養に戻すことができる。]
[0024] 本方法は、好ましくは、培養の各サイクル中に、マトリックスコートしたマイクロキャリアに継代前に幹細胞を付着させる工程を伴う。しかし、ある培養サイクルをコートしていないマイクロキャリア上で行なうことが許容される；ただし、継代を伴う培養サイクルを全体として合計で少なくとも３回は、マトリックスコートしたマイクロキャリア上で行なうことが好ましいであろう。より好ましくは、これは少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、またはそれ以上の培養サイクルのいずれかであろう。]
[0025] したがって、本発明方法はインビトロ培養における多分化能性幹細胞の長期継代を提供し、その際、幹細胞は安定に培養および継代されてそれらの多分化能状態は保存される。
本発明の他の観点は、マイクロキャリアに付着した多分化能性幹細胞の分化に関する。]
[0026] ある態様において、前記の観点に記載したマイクロキャリア培養法を用いることにより、多分化能性幹細胞を分化に必要な細胞密度まで成長させることができる。必要な細胞密度が得られた時点で、マイクロキャリアに付着した幹細胞の分化を誘導するように培養条件を変更することができる。分化のためには、幹細胞の成長に用いたものと比較して同一または異なるマイクロキャリアを使用できる。同様に、同一または異なるマトリックスコーティングを使用できる。たとえば、第１コーティングをもつ第１マイクロキャリアを多分化能性幹細胞の成長および増殖のために用い、第２コーティングをもつ第２マイクロキャリアをそれらの幹細胞の分化のために用いることができる。分化のためには、マイクロキャリアはコートされていなくてもよい。]
[0027] 幹細胞の増殖とそれらの分化の両方にマイクロキャリア培養を採用することは、分化用培養に増殖培養物を再接種する必要性が避けられ、これによって多数の多分化能性細胞が分化のために供給され、かつ培養条件の変更により増殖から分化へ簡便に変更されるという利点をもつ。]
[0028] 他の態様においては、他の培養法、たとえば２Ｄコロニー培養によって、分化のための多分化能性幹細胞を必要な細胞密度まで成長させることができる。次いで、マトリックスコーティングをもつマイクロキャリアにこれらの細胞を付着させ、幹細胞の分化を誘導する条件下で懸濁培養において培養する。]
[0029] ある態様においては、既に分化（ただし、好ましくは最終分化ではない）を行なった細胞を、マトリックスコーティングをもつマイクロキャリアまたはコーティングしていないマイクロキャリアに付着させ、幹細胞の分化を誘導する条件下で懸濁培養において培養す
ることができる。]
[0030] 本発明の１観点によれば、幹細胞をインビトロで懸濁培養において培養する方法が提供され、この方法は、
（ｉ）幹細胞を複数のマイクロキャリアに付着させてマイクロキャリア幹細胞複合体を形成し、その際、マイクロキャリアの表面はマトリックス中にコートされており；
（ｉｉ）マイクロキャリア幹細胞複合体を懸濁培養において培養し；
（ｉｉｉ）（ｉｉ）からの培養細胞を継代し；そして
（ｉｖ）工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）を通して少なくとも３継代反復する
ことを含み、その際、工程（ｉｖ）の後の培養物中の幹細胞は多分化能性である。]
[0031] 幹細胞は、好ましくは胚性幹細胞または誘導された多分化能性幹細胞であり、好ましくは霊長類またはヒトのものである。
マトリックスは、好ましくは細胞外マトリックス成分を含む。より好ましくは、マトリックスはＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ヒアルロン酸、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、コラーゲン、エラスチン、ヘパラン硫酸、デキストラン、デキストラン硫酸、コンドロイチン硫酸のうち１以上を含む。マトリックスは、ラミニン、Ｉ型コラーゲン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、およびエンタクチン１の混合物を含むことができる。]
[0032] マイクロキャリアは、セルロース、デキストラン、ヒドロキシル化メタクリレート、コラーゲン、ゼラチン、ポリスチレン、プラスチック、ガラス、セラミック、シリコーンのうち１以上を含むか、あるいはそれらからなることができる。あるいは、マイクロキャリアはマクロ多孔質またはミクロ多孔質のｃａｒｂｏｓｅｅｄマイクロキャリアである。マイクロキャリアは、プロタミンまたはポリリジンとカップリングしていてもよい。]
[0033] マイクロキャリアは、好ましくは陽電荷をもち、好ましくは表面陽電荷をもつ。それは親水性であってもよい。マイクロキャリアは、好ましくはロッド形、たとえば円筒形、または実質的に球形の形状である。]
[0034] 好ましくは、工程（ｉｉ）において、培養物中の幹細胞の数を拡張させるのに十分な期間、幹細胞を培養する。ある態様では、各反復サイクルにおいて、工程（ｉ）の幹細胞はその前の反復サイクルの工程（ｉｉｉ）の継代細胞から得られる。]
[0035] 本発明の態様において、工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）を通して少なくとも４継代、少なくとも５継代、少なくとも６継代、少なくとも７継代、少なくとも８継代、少なくとも９継代、少なくとも１０継代、少なくとも１１継代、少なくとも１２継代、少なくとも１３継代、少なくとも１４継代、少なくとも１５継代、少なくとも１６継代、少なくとも１７継代、少なくとも１８継代、少なくとも１９継代、少なくとも２０継代、少なくとも２１継代、少なくとも２２継代、少なくとも２３継代、少なくとも２４継代、少なくとも２５継代、少なくとも３０継代、少なくとも４０継代、少なくとも５０継代、少なくとも６０継代、少なくとも７０継代、少なくとも８０継代、少なくとも９０継代、少なくとも１００継代のいずれか反復する。]
[0036] 好ましい態様では、工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）のサイクルの少なくとも６０％において、マイクロキャリアがマトリックス中にコートされている。あるいは、これは少なくとも７０％、８０％、９０％または９５％のいずれかであってもよい。工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）の連続サイクル中に、マイクロキャリアは同一マトリックス中にコートされていてもよく、あるいは、工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）の第１および第２の連続サイクルにおいて、マトリックスが異なるか、または存在しなくてもよい。]
[0037] 好ましい態様において、工程（ｉｖ）の後、培養物中の少なくとも６０％の幹細胞が多分化能性である。あるいは、これは少なくとも７０％、８０％、９０％または９５％のいずれかであってもよい。]
[0038] 好ましい態様において、工程（ｉｖ）の後、培養物中の少なくとも６０％の幹細胞が、Ｏｃｔ４、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ−１−６０およびＭａｂ８４のうち１、２、３またはすべてを発現する。あるいは、これは少なくとも７０％、８０％、９０％または９５％のいずれかであってもよい。]
[0039] ある態様において、本方法は、幹細胞を無血清培地、または幹細胞用馴化培地、またはフィーダー細胞を含まない状態で培養することを含むことができる。
他の態様において、フィーダー細胞がマイクロキャリアに付着してもよい。フィーダー細胞は、幹細胞が付着するマイクロキャリアとは異なるマイクロキャリアに付着してもよい。]
[0040] 本発明は、本発明方法により得られる多分化能性幹細胞を含む。
他の態様において、本方法はさらに、工程（ｉｖ）の後に得られる幹細胞の分化を誘導する工程を含むことができる。これは、幹細胞の分化を誘導する条件下にマイクロキャリア幹細胞複合体を置くことにより達成できる。あるいは、本方法は、工程（ｉｖ）の後に、幹細胞をマイクロキャリアから分離し、そして分離した幹細胞をマイクロキャリアの無い培養において、幹細胞の分化を誘導する条件下で培養する工程を含むことができる。]
[0041] したがって、ある態様において本方法は、さらに多分化能性幹細胞の分化を含むことができ、これは
（ｖ）工程（ｉｖ）の後に得られる多分化能性幹細胞を複数の第２マイクロキャリアに付着させてマイクロキャリア幹細胞複合体を形成し、その際、第２マイクロキャリアの表面は第２マトリックス中にコートされているか、またはコートされておらず；そして
（ｖｉ）（ｖ）からのマイクロキャリア幹細胞複合体を懸濁培養において、幹細胞の分化を誘導する条件下で培養する
ことを含む。]
[0042] 第１マトリックスと第２マトリックスは同一でも異なってもよい。第１マイクロキャリアと第２マイクロキャリアは同一でも異なってもよい。
ある態様においては、さらなる分化を誘導することができ、その際、本方法はさらに、
（ｖｉｉ）工程（ｖｉ）から得られる分化した幹細胞を複数の第３マイクロキャリアに付着させてマイクロキャリア幹細胞複合体を形成し、その際、第３マイクロキャリアの表面は第３マトリックス中にコートされているか、またはコートされておらず；そして
（ｖｉｉｉ）（ｖｉｉ）からのマイクロキャリア幹細胞複合体を懸濁培養において、分化した幹細胞のさらなる分化を誘導する条件下で培養する
ことを含む。]
[0043] 第３マトリックスは、第１および第２マトリックスと異なってもよく、あるいは第１および第２マトリックスのいずれか１つと同一であってもよい。第３マイクロキャリアは、第１および第２マイクロキャリアと異なってもよく、あるいは第１および第２マイクロキャリアのいずれか１つと同一であってもよい。]
[0044] 本発明は、本発明方法により得られる分化した細胞を含む。
本発明方法により得られる分化した細胞を培養して胚様体を形成させることができる。胚様体をマイクロキャリアに付着させることができる。こうして得られる胚様体は本発明
の一部を形成する。]
[0045] 本発明の他の観点においては、幹細胞をインビトロで懸濁培養において培養する方法が提供され、この方法は、
（ｉ）幹細胞を複数のマイクロキャリアに付着させてマイクロキャリア幹細胞複合体を形成し、その際、マイクロキャリアの表面はＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）中にコートされており；
（ｉｉ）マイクロキャリア幹細胞複合体を懸濁培養において培養し；
（ｉｉｉ）（ｉｉ）からの培養細胞を継代し；そして
（ｉｖ）工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）を通して少なくとも７継代反復する
ことを含み、その際、工程（ｉｖ）の後の培養物中の幹細胞は多分化能性であり、培養物はフィーダー細胞を含まず、各継代間で幹細胞の数が拡張し、幹細胞はヒトもしくは霊長類の胚性幹細胞またはヒトもしくは霊長類の誘導された多分化能性幹細胞である。]
[0046] 本発明の他の観点においては、幹細胞をインビトロで培養し、かつ分化させる方法が提供され、この方法は、
（ｉ）幹細胞を複数の第１マイクロキャリアに付着させてマイクロキャリア幹細胞複合体を形成し、その際、第１マイクロキャリアの表面は第１マトリックス中にコートされており；
（ｉｉ）マイクロキャリア幹細胞複合体を懸濁培養において培養し；
（ｉｉｉ）（ｉｉ）からの培養細胞を継代し；そして
（ｉｖ）工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）を通して少なくとも３継代反復する
ことを含み、その際、工程（ｉｖ）の後の培養物中の幹細胞は多分化能性であり、この方法はさらに、
（ｖ）工程（ｉｖ）の後に得られる多分化能性幹細胞を複数の第２マイクロキャリアに付着させてマイクロキャリア幹細胞複合体を形成し、その際、第２マイクロキャリアの表面は第２マトリックス中にコートされているか、またはコートされておらず；そして
（ｖｉ）（ｖ）からのマイクロキャリア幹細胞複合体を懸濁培養において、幹細胞の分化を誘導する条件下で培養する
ことを含む。]
[0047] 第１マトリックスと第２マトリックスは同一でも異なってもよい。第１マイクロキャリアと第２マイクロキャリアは同一でも異なってもよい。
本方法はさらに、
（ｖｉｉ）工程（ｖｉ）から得られる分化した幹細胞を複数の第３マイクロキャリアに付着させてマイクロキャリア幹細胞複合体を形成し、その際、第３マイクロキャリアの表面は第３マトリックス中にコートされているか、またはコートされておらず；そして
（ｖｉｉｉ）（ｖｉｉ）からのマイクロキャリア幹細胞複合体を懸濁培養において、分化した幹細胞のさらなる分化を誘導する条件下で培養する
ことを含むことができる。]
[0048] 第３マトリックスは、第１および第２マトリックスと異なってもよく、あるいは第１および第２マトリックスの１つと同一であってもよい。第３マイクロキャリアは、第１および第２マイクロキャリアと異なってもよく、あるいは第１および第２マイクロキャリアの１つと同一であってもよい。]
[0049] 本発明の他の観点においては、幹細胞をインビトロで分化させる方法が提供され、この方法は、多分化能性幹細胞を複数のマイクロキャリアに付着させてマイクロキャリア幹細胞複合体を形成し、その際、マイクロキャリアの表面は第２マトリックス中にコートされているか、またはコートされておらず、そしてマイクロキャリア幹細胞複合体を懸濁培養
において、幹細胞の分化を誘導する条件下で培養することを含む。]
[0050] 幹細胞は、好ましくは胚性幹細胞または誘導された多分化能性幹細胞であり、好ましくは霊長類またはヒトのものである。
マトリックスは、好ましくは細胞外マトリックス成分を含む。より好ましくは、マトリックスはラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ヒアルロン酸、コラーゲン、エラスチン、ヘパラン硫酸、デキストラン、デキストラン硫酸、コンドロイチン硫酸のうち１以上を含む。マトリックスは、ラミニン、Ｉ型コラーゲン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、およびエンタクチン１の混合物を含むことができる。]
[0051] マイクロキャリアは、セルロース、デキストラン、ヒドロキシル化メタクリレート、コラーゲン、ゼラチン、ポリスチレン、プラスチック、ガラス、セラミック、シリコーンのうち１以上を含むか、あるいはそれらからなることができる。あるいは、マイクロキャリアはマクロ多孔質またはミクロ多孔質のｃａｒｂｏｓｅｅｄマイクロキャリアであってもよい。マイクロキャリアはプロタミンまたはポリリジンとカップリングしていてもよい。]
[0052] マイクロキャリアは、好ましくは陽電荷をもち、好ましくは表面陽電荷をもつ。それは親水性であってもよい。マイクロキャリアは、好ましくはロッド形、たとえば円筒形、または実質的に球形の形状である。]
[0053] 本発明の他の観点においては、霊長類またはヒトの幹細胞の伝播のための、マトリックス中にコートされたマイクロキャリアの使用が提供され、マイクロキャリアはＤＥ−５２（Ｗｈａｔｍａｎ）、ＤＥ−５３（Ｗｈａｔｍａｎ）、ＱＡ−５２（Ｗｈａｔｍａｎ）、ＴＳＫｇｅｌ Ｔｒｅｓｙｌ−５Ｐｗ（東ソー）またはＴｏｙｏｐｅａｒｌＡＦ−Ｔｒｅｓｙｌ−６５０（東ソー）、ＳＭ１０１０（Ｂｌｕｅ Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ）およびＳＨ１０１０（Ｂｌｕｅ Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ）から選択される。]
[0054] マトリックスは、好ましくは細胞外マトリックス成分を含む。より好ましくは、マトリックスはＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ヒアルロン酸、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、コラーゲン、エラスチン、ヘパラン硫酸、デキストラン、デキストラン硫酸、コンドロイチン硫酸のうち１以上を含む。マトリックスは、ラミニン、Ｉ型コラーゲン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、およびエンタクチン１の混合物を含むことができる。]
[0055] 本発明の一部として、本明細書に記載する方法は、多分化能性ではない（ｎｏｎ−ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞、特に多能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞、たとえば成体幹細胞、または多分化能性幹細胞に由来する多能性幹細胞（たとえば胚性幹細胞に由来する多能性幹細胞）の安定な長期培養を達成するためにも使用できる。多能性幹細胞はヒトまたは霊長類の多分化能性幹細胞、たとえばｈＥＳＣに由来するものであってもよい。]
[0056] 本明細書に記載する方法の使用により、多能性幹細胞（たとえば成体幹細胞）を各継代間で連続拡張させることができ、かつ拡張した成体幹細胞集団の多能性を少なくとも２継代を超えて、より好ましくは３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５継代のうちのいずれかを超えて維持することができる。]
[0057] したがって、多能性幹細胞の培養、成長、伝播および分化は、幹細胞、たとえばヒトまたは霊長類の胚性幹細胞の培養、成長、分化および伝播のための本明細書に記載するいず
れかの方法、観点、態様、および好ましい特徴に従って実施できる。多能性幹細胞の培養、成長、増殖および／または分化のために用いるマイクロキャリアはコートされていなくてもよく、あるいはマトリックスコーティングをもつこともできる。]
[0058] これによれば、本発明の他の観点において、多能性幹細胞をインビトロで懸濁培養において培養する方法が提供され、この方法は、
（ｉ）多能性幹細胞を複数のマイクロキャリアに付着させてマイクロキャリア幹細胞複合体を形成し；
（ｉｉ）マイクロキャリア幹細胞複合体を懸濁培養において培養する
ことを含み、その際、工程（ｉｉ）の後の培養物中の幹細胞は多能性である。]
[0059] 本発明の他の観点においては、多能性幹細胞をインビトロで懸濁培養において培養する方法が提供され、この方法は、
（ｉ）多能性幹細胞を複数のマイクロキャリアに付着させてマイクロキャリア幹細胞複合体を形成し；
（ｉｉ）マイクロキャリア幹細胞複合体を懸濁培養において培養し；
（ｉｉｉ）（ｉｉ）からの培養細胞を継代し；そして
（ｉｖ）工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）を通して少なくとも２継代反復する
ことを含み、その際、工程（ｉｖ）の後の培養物中の幹細胞は多能性である。]
[0060] 上記の２観点のある態様において、工程（ｉ）においてマイクロキャリアの表面はマトリックス中にコートされている。
これらの方法により得られる多能性幹細胞も提供される。]
[0061] 本発明の他の観点においては、多能性幹細胞をインビトロで培養し、かつ分化させる方法が提供され、この方法は、
（ｉ）幹細胞を複数の第１マイクロキャリアに付着させてマイクロキャリア幹細胞複合体を形成し；
（ｉｉ）マイクロキャリア幹細胞複合体を懸濁培養において培養し；
（ｉｉｉ）（ｉｉ）からの培養細胞を継代し；そして
（ｉｖ）工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）を通して少なくとも２継代反復する
ことを含み、その際、工程（ｉｖ）の後の培養物中の幹細胞は多能性であり、該方法はさらに、
（ｖ）工程（ｉｖ）の後に得られる多能性幹細胞を複数の第２マイクロキャリアに付着させてマイクロキャリア幹細胞複合体を形成し、その際、第２マイクロキャリアの表面は第２マトリックス中にコートされているか、またはコートされておらず；そして
（ｖｉ）（ｖ）からのマイクロキャリア幹細胞複合体を懸濁培養において、幹細胞の分化を誘導する条件下で培養する
ことを含む。]
[0062] ある態様において、工程（ｉ）においてマイクロキャリアの表面は第１マトリックス中にコートされている。
本発明の他の観点においては、幹細胞をインビトロで分化させる方法が提供され、この方法は、多能性幹細胞を複数のマイクロキャリアに付着させてマイクロキャリア幹細胞複合体を形成し、その際、マイクロキャリアの表面は第２マトリックス中にコートされているか、またはコートされておらず、そしてマイクロキャリア幹細胞複合体を懸濁培養において、幹細胞の分化を誘導する条件下で培養することを含む。]
[0063] これらの方法により得られる分化した細胞も提供される。
本発明の１観点によれば、それにコートされたマトリックスを含み、陽電荷をもつ粒子
が提供され、この粒子はそれに付着した霊長類またはヒトの幹細胞を集合させることができるサイズのものである。]
[0064] 本発明の粒子は、実質的に細長い、円筒形もしくはロッドの形状の粒子、または実質的にコンパクトな、もしくは球形の形状の粒子を含むことができる。
本発明の粒子は、５０μｍ〜４００μｍの最長寸法をもつ、実質的に細長い、円筒形もしくはロッドの形状の粒子を含むことができる。粒子は約２００μｍの最長寸法を含むことができる。粒子は２０μｍ〜３０μｍの最短寸法を含むことができる。粒子は、円筒形のセルロースマイクロキャリアを含むことができる。]
[0065] 本発明の粒子は、ＤＥ−５２（Ｗｈａｔｍａｎ）、ＤＥ−５３（Ｗｈａｔｍａｎ）またはＱＡ−５２（Ｗｈａｔｍａｎ）を含むことができる。
本発明の粒子は、約２０μｍ〜約１２０μｍのサイズをもつ実質的にコンパクトな、または球形の形状の粒子を含むことができる。粒子は約６５μｍのサイズをもつことができる。粒子は、親水性マイクロキャリア、ヒドロキシル化メタクリル系マトリックスマイクロキャリア、または誘導体化した親水性ビーズ状（ｂｅａｄｅｄ）マイクロキャリアを含むことができる。]
[0066] 本発明の粒子は、ＴＳＫｇｅｌ Ｔｒｅｓｙｌ−５Ｐｗ（東ソー）またはＴｏｙｏｐｅａｒｌＡＦ−Ｔｒｅｓｙｌ−６５０（東ソー）を含むことができる。
本発明の粒子は、マクロ多孔質またはミクロ多孔質のｃａｒｂｏｓｅｅｄマイクロキャリアを含むことができる。粒子は、ＳＭ１０１０（Ｂｌｕｅ Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ）およびＳＨ１０１０（Ｂｌｕｅ Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ）を含むことができる。]
[0067] 本発明の粒子は陽電荷をもつように誘導体化されていてもよい。粒子は、粒子の乾燥物質重量グラム当たり１〜２ミリ当量の小さなイオン交換容量の第三級アミンまたは第四級アミンとカップリングしていてもよい。粒子は、最高２０ｍｇ／粒子ｍｌの濃度の硫酸プロタミンまたはポリ−Ｌ−リジン臭化水素酸塩とカップリングしていてもよい。粒子の陽電荷は、０．５〜４ミリ当量単位／ｍｌ（ｍＥｑ）であってよい。]
[0068] マトリックスは、幹細胞の成長を可能にする生理学的関連マトリックスを含むことができる。マトリックスは、細胞外マトリックス成分を含むことができる。マトリックスは、Ｍａｔｒｉｇｅｌ、ヒアルロン酸、ウシのガラス体液に由来するヒアルロン酸、連鎖球菌（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）に由来するヒアルロン酸ナトリウム、ヘパラン硫酸、ウシの腎臓に由来するヘパラン硫酸、デキストラン硫酸、デキストラン硫酸ナトリウム、ヘパリン硫酸およびコンドロイチン硫酸からなる群から選択することができる。マトリックスは、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含むことができる。]
[0069] 本発明の他の観点によれば、前記の本発明の観点による粒子であって、それに付着した霊長類またはヒトの幹細胞を含むものが提供される。
本明細書に記載する本発明の観点、態様および特徴によれば、多分化能性細胞または多能性細胞のインビトロ懸濁培養に使用するのに適切な粒子またはマイクロキャリアが提供され、これにより、多分化能性もしくは多能性の状態を有する新たな細胞または多分化能性もしくは多能性細胞の分化の産物である細胞が生成し、これらの粒子またはマイクロキャリアは、コンパクトな、または細長い形状をもち、約２０００μｍ未満の最長寸法および約１０μｍより大きい最短寸法をもち、その際、マイクロキャリアの表面はマトリックス中にコートされており、多数の多分化能性細胞または多能性細胞がマトリックスに付着している。ある態様において、マトリックスコーティングはマトリックスの層、好ましくは薄層の形である。]
[0070] １態様においてはマイクロキャリアが提供され、その際、マイクロキャリアは多分化能性細胞または多能性細胞をインビトロ懸濁培養において成長および／または分化させる際に使用するのに適切であり、マイクロキャリアはセルロース、デキストラン、ヒドロキシル化メタクリレート、またはコラーゲンのうち１以上を含み、マイクロキャリアは細長い形状をもち、約２０００μｍ未満の最長寸法および約１０μｍより大きい最短寸法をもち、マイクロキャリアの表面はマトリックス中にコートされており、１個または複数の多分化能性細胞または多能性細胞がマトリックスコーティングに付着している。]
[0071] ある態様において、マイクロキャリアはロッド形である。ある態様において、マトリックスコーティングは、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ヒアルロン酸、ラミニンまたはフィブロネクチンのうち１以上を含む。ある態様において、マイクロキャリアは陽電荷をもち、あるいは表面陽電荷をもつ。ある態様において、マイクロキャリアの最長寸法は５０μｍ〜４００μｍである。]
[0072] ２種類以上の前記マイクロキャリアを含む集合体も提供される。
多分化能性または多能性の状態をもつ新たな細胞を生成するための多分化能性細胞または多能性細胞のインビトロでの培養における、マイクロキャリアの使用も提供される。多分化能性細胞または多能性細胞のインビトロ分化における、マイクロキャリアの使用も提供される。したがって、多分化能性細胞または多能性細胞をインビトロで培養して多分化能性または多能性の状態をもつ新たな細胞を生成する方法であって、多分化能性または多能性の状態をもつ新たな細胞を生成するのに適切な条件下でマイクロキャリアを培養することを含む方法も提供される。多分化能性細胞または多能性細胞をインビトロで分化させる方法であって、多分化能性細胞または多能性細胞の分化を誘導する条件下でマイクロキャリアを培養することを含む方法も提供される。]
[0073] 本発明者らは、本発明の他の観点により、霊長類またはヒトの幹細胞を伝播させる方法を提供し、この方法は（ａ）第１粒子に付着した霊長類またはヒトの第１幹細胞を用意し；（ｂ）第２粒子に付着した霊長類またはヒトの第２幹細胞を用意し；（ｃ）霊長類またはヒトの第１幹細胞を霊長類またはヒトの第２幹細胞に接触させて細胞の集合体を形成させ；そして（ｄ）集合体を培養して霊長類またはヒトの幹細胞を少なくとも１継代伝播させることを含み；その際、第１および第２粒子はそれぞれその上にコートされたマトリックスを含み、陽電荷をもち、粒子はそれに付着した霊長類またはヒトの幹細胞を集合させることができるサイズのものである。]
[0074] 前記の粒子または各粒子は、前記の本発明の観点に述べた特徴を含むことができる。
この方法は、霊長類またはヒトの幹細胞を多数継代、連続伝播させるのを可能にすることができる。この方法は、霊長類またはヒトの幹細胞を少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１２、少なくとも１３、または少なくとも１４継代、連続伝播させるのを可能にすることができる。この方法は、２Ｄコロニー培養への、または２Ｄコロニー培養からの継代を含むことができる。]
[0075] 前記の方法は、霊長類またはヒトの幹細胞の凍結および融解を含むことができる。この方法は、３０ｒｐｍ以上、または１００ｒｐｍ以上での撹拌を含むことができる。この方法は、霊長類またはヒトの幹細胞を２５ｍｌ以上または５０ｍｌ以上の体積で伝播させるのを含むことができる。この方法は、霊長類またはヒトの幹細胞をスピナー懸濁培養において伝播させるのを含むことができる。]
[0076] 伝播した霊長類またはヒトの幹細胞は、前記の回数の継代後、霊長類またはヒトの幹細胞の生物活性のうち少なくとも１つを保持することができる。霊長類またはヒトの幹細胞
の生物活性は、（ｉ）多分化能性マーカーの発現；（ｉｉ）細胞の生存率；（ｉｉｉ）正常な核型（ｋａｒｙｏｔｙｐｅ）；（ｉｖ）内胚葉、外胚葉および中胚葉に分化する能力からなる群から選択できる。霊長類またはヒトの幹細胞の生物活性は、ＯＣＴ−４、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０およびＭａｂ８４からなる群から選択される多分化能性マーカーの発現を含むことができる。]
[0077] 前記の方法は、霊長類またはヒトの幹細胞を１：６以上、１：１０以上、１：１５以上、１：２０以上、または１：２６以上の分割比率（ｓｐｌｉｔ ｒａｔｉｏ）で継代するのを可能にすることができる。前記の方法は、霊長類またはヒトの幹細胞を２００万細胞／ｍｌ以上の体積生産量にまで伝播させることができる。]
[0078] 前記の方法は、霊長類またはヒトの幹細胞を無血清培地または幹細胞用馴化培地中で伝播させることを含むことができる。
前記の方法は、さらに、霊長類またはヒトの幹細胞を粒子から分離する工程を含むことができる。]
[0079] 本発明の他の観点として、分化した細胞を生成する方法が提供され、この方法は、本発明の前記の観点により霊長類またはヒトの幹細胞を伝播させ、そして霊長類またはヒトの幹細胞を分化させることを含む。]
[0080] 本発明者らは、本発明の他の観点により、胚様体を生成するための方法を提供し、この方法は、本発明の前記の観点により霊長類またはヒトの幹細胞を伝播させ、そして霊長類またはヒトの幹細胞を培養して胚様体を形成させることを含む。]
[0081] 本発明は、他の観点において、処置の必要な個体において疾患を処置する方法を提供し、この方法は、本発明の前記の観点により霊長類またはヒトの幹細胞を伝播させ、本発明の前記の観点により分化した細胞を生成し、あるいは本発明の前記の観点により胚様体を形成し、そして霊長類またはヒトの幹細胞、分化した細胞、または胚様体を個体に投与することを含む。]
[0082] 霊長類またはヒトの幹細胞は、霊長類もしくはヒトの胚性幹細胞、霊長類もしくはヒトの成体幹細胞、または霊長類もしくはヒトの誘導された多分化能性幹細胞を含むことができる。]
[0083] 本発明の他の観点においては、それに幹細胞が付着した２以上の粒子を含む（それぞれ本発明のいずれかの観点による）集合体が提供される。
本発明の他の観点により、本発明者らは、本発明の観点による粒子または本発明の上記の観点による集合体を含む、細胞培養物を提供する。]
[0084] 本発明者らは、本発明の他の観点により、本発明の観点による粒子または本発明の前記の観点による集合体を細胞培養培地と共に含む、容器を提供する。
本発明の他の観点によれば、霊長類またはヒトの幹細胞を伝播させるためのデバイスが提供され、このデバイスは、本発明の観点による粒子または本発明の前記の観点による集合体を含む。]
[0085] 前記の容器またはデバイスはバイオリアクターであってもよい。
本発明の他の観点として、本発明者らは、本発明の前記の観点による方法により伝播させた霊長類またはヒトの幹細胞、本発明の前記の観点による方法により生成した分化した細胞、または本発明の前記の観点による方法により生成した胚様体を提供する。]
[0086] 本発明の他の観点によれば、霊長類またはヒトの幹細胞を伝播および／または分化させるための粒子の使用が提供され、この粒子はＤＥ−５２（Ｗｈａｔｍａｎ）、ＤＥ−５３（Ｗｈａｔｍａｎ）、ＱＡ−５２（Ｗｈａｔｍａｎ）、ＴＳＫｇｅｌ Ｔｒｅｓｙｌ−５Ｐｗ（東ソー）またはＴｏｙｏｐｅａｒｌＡＦ−Ｔｒｅｓｙｌ−６５０（東ソー）、ＳＭ１０１０（Ｂｌｕｅ Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ）およびＳＨ１０１０（Ｂｌｕｅ Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ）から選択される。]
[0087] 本発明の１観点によれば、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）をインビトロ懸濁培養において伝播させる方法が提供され、この方法は、
（ｉ）ｈＥＳＣを複数のマイクロキャリアに付着させ；
（ｉｉ）（ｉ）からのマイクロキャリアを懸濁培養において、ｈＥＳＣの数を拡張させるのに十分な期間、培養し；
（ｉｉｉ）（ｉｉ）からの拡張したｈＥＳＣ集団を継代し；
（ｉｖ）工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）を通して少なくとも５継代反復し、その際、各反復サイクルにおいて、工程（ｉ）のｈＥＳＣはその前の反復サイクルの工程（ｉｉｉ）の継代細胞から得られる
ことを含み、その際、工程（ｉｖ）の後の培養物中のｈＥＳＣは多分化能性であり、マイクロキャリアは
（ａ）最長寸法が２５０μｍ〜１０μｍであるコンパクトな形状；または
（ｂ）細長い形状
をもち、マイクロキャリアはＭａｔｒｉｇｅｌおよびヒアルロン酸のうち一方または両方を含むマトリックスコーティングでコートされている。]
[0088] マイクロキャリアに付与されるマトリックスコーティングは、場合によりＭａｔｒｉｇｅｌおよび／またはヒアルロン酸からなることができる。
ある好ましい態様において、マイクロキャリアは実質的に球形の形状であり、９０μｍ〜１０μｍ、より好ましくは８０μｍ〜４０μｍ、または７０μｍ〜５０μｍの直径をもつ。ある態様において、マイクロキャリアは実質的に球形の形状であり、約６５μｍの直径をもつ。]
[0089] 他の好ましい態様において、マイクロキャリアはロッド形である。好ましくは、ロッド形のマイクロキャリアは２０００μｍ〜２０μｍの最長寸法をもつ。好ましい態様において、マイクロキャリアは、プラスチック、ガラス、セラミック、シリコーン、ゼラチン、デキストラン、セルロース、ヒドロキシル化メタクリレート、ポリスチレン、またはコラーゲンのうち１以上から構成される。特に好ましい態様において、マイクロキャリアはセルロース、デキストランまたはポリスチレンマイクロキャリアである。好ましいマイクロキャリアは、ＴＳＫｇｅｌ Ｔｒｅｓｙｌ−５Ｐｗ（東ソー）；ＴｏｙｏｐｅａｒｌＡＦ−Ｔｒｅｓｙｌ−６５０（東ソー）、ＤＥ−５２、ＤＥ−５３、ＱＡ−５２、Ｃｙｔｏｄｅｘ １、Ｃｙｔｏｄｅｘ ３、Ｈｉｌｌｅｘ、Ｈｉｌｌｅｘ ＩＩから選択される。ある態様において、マクロ多孔質またはミクロ多孔質のｃａｒｂｏｓｅｅｄマイクロキャリアである。マイクロキャリアは、たとえばプロタミンまたはポリリジンで誘導体化されて、陽電荷を生じてもよい。]
[0090] ある態様では、継代の前に、工程（ｉｉ）においてｈＥＳＣを集密状態またはほぼ集密状態にまで拡張させる。ｈＥＳＣを各工程（ｉｉ）において、または前記方法全体において拡張させて、これによりｈＥＳＣの集団を、継代前に、工程（ｉ）でマイクロキャリアに付着させたｈＥＳＣの数より少なくとも０．２、少なくとも０．４、少なくとも０．５、少なくとも０．６、少なくとも０．８、または少なくとも１桁のいずれかで多くなるようにすることができる。ｈＥＳＣを各工程（ｉｉ）において、または前記方法全体において拡張させて、これによりｈＥＳＣの集団を、継代前に、工程（ｉ）でマイクロキャリア
に付着させたｈＥＳＣの数より少なくとも２、３、４、５、１０または２０倍のいずれかで多くなるようにすることができる。]
[0091] 工程（ｉｖ）において、好ましくは工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）を通して少なくとも６継代、少なくとも７継代、少なくとも８継代、少なくとも９継代、少なくとも１０継代、少なくとも１１継代、少なくとも１２継代、少なくとも１３継代、少なくとも１４継代、少なくとも１５継代、少なくとも１６継代、少なくとも１７継代、少なくとも１８継代、少なくとも１９継代、少なくとも２０継代、少なくとも２１継代、少なくとも２２継代、少なくとも２３継代、少なくとも２４継代、少なくとも２５継代、少なくとも３０継代、少なくとも４０継代、少なくとも５０継代、少なくとも６０継代、少なくとも７０継代、少なくとも８０継代、少なくとも９０継代、少なくとも１００継代のいずれか反復する。]
[0092] 前記の方法において、拡張したヒト胚性幹細胞の有意割合が多分化能性であろう。好ましい態様においては、工程（ｉｖ）の後、培養物中の少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または実質的に１００％のｈＥＳＣが多分化能性である。]
[0093] 多分化能性は、Ｏｃｔ４、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ−１−６０およびＭａｂ８４のうち１、２、３またはすべての発現を検出することにより測定できる。好ましい態様においては、工程（ｉｖ）の後、培養物中の少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または実質的に１００％のｈＥＳＣが、Ｏｃｔ４、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ−１−６０およびＭａｂ８４のうち１、２、３またはすべてを発現する。]
[0094] ある態様において、本方法は、培養物から得られる細胞総数において培養開始時の細胞数と比較してｌｏｇ１０の差を達成するのに十分な継代を継続することができる。
ある態様においては、ヒト胚性幹細胞をフィーダー細胞と共培養することができる。フィーダー細胞は培養物に添加するマイクロキャリアに付着させることができる。これらのマイクロキャリアは、本明細書に記載するように、場合によりマトリックスコーティング中にコートされていてもよい。あるいは、コートされていないマイクロキャリアにフィーダー細胞を付着させてもよい。ある態様においては、フィーダー細胞と幹細胞を同一マイクロキャリア（１以上）に接種することができる。]
[0095] 好ましくは、ヒト胚性幹細胞数の拡張は、実質的にあらゆる継代間で起きる；たとえば、ヒト胚性幹細胞の数は少なくとも７０％の継代間で、より好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または実質的に１００％の継代間で増加する。]
[0096] 本発明による方法は、別の培養システム、たとえば２Ｄ培養への継代またはそれからの継代を含むことができる。培養システム間での移植を容易にするために、細胞をたとえば凍結して保存し、そして融解することができる。]
[0097] ある態様においては、ヒト胚性幹細胞を、限られた期間、他の粒子／表面で培養することができる。たとえば、工程（ｉｉ）または（ｉｉｉ）からのヒト胚性幹細胞を、限られた継代回数（たとえば５未満、より好ましくは３未満、より好ましくは１）について２Ｄ培養において培養した後、マトリックスコートしたマイクロキャリア上での培養に戻すことができる。同様な例で、工程（ｉｉ）または（ｉｉｉ）からのヒト胚性幹細胞を、限られた継代回数（たとえば５未満、より好ましくは３未満、より好ましくは１）についてマトリックスコートしていないマイクロキャリア上で培養した後、マトリックスコートしたマイクロキャリア上での培養に戻すことができる。]
[0098] ある態様においては、ヒト胚性幹細胞を前記の培養法から取り出して、限られた継代回数（たとえば５未満、より好ましくは３未満、より好ましくは１）について別の培養システムで維持した後、本発明による懸濁培養に戻すことができる。]
[0099] 他の態様においては、ヒト胚性幹細胞を前記の培養法から取り出し、保存（たとえば凍結細胞として）した後、本発明による懸濁培養に戻すことができる。
そのような態様において、本発明による懸濁培養に戻すのは同一培養に戻すことを必要としない。本発明による懸濁培養は、たとえば細胞の凍結および／または移植の後に、異なる場所で継続することすらできる。]
[0100] したがって、本発明の他の観点においては、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）をインビトロ懸濁培養において伝播させる方法が提供され、この方法は、
（ｉ）ｈＥＳＣを複数のマイクロキャリアに付着させ；
（ｉｉ）（ｉ）からのマイクロキャリアを懸濁培養において、ｈＥＳＣの数を拡張させるのに十分な期間、培養し；
（ｉｉｉ）（ｉｉ）からの拡張したｈＥＳＣ集団を継代し；
（ｉｖ）工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）を通して少なくとも５継代反復し、その際、各反復サイクルにおいて、工程（ｉ）のｈＥＳＣはその前の反復サイクルの工程（ｉｉｉ）の継代細胞から得られる
ことを含み、その際、工程（ｉｖ）の後の培養物中のｈＥＳＣは多分化能性であり、マイクロキャリアは
（ａ）最長寸法が２５０μｍ〜１０μｍであるコンパクトな形状；または
（ｂ）細長い形状
をもち、その際、工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）のサイクルの少なくとも６０％について、マイクロキャリアはＭａｔｒｉｇｅｌおよびヒアルロン酸のうち一方または両方を含むマトリックスコーティング中にコートされている。]
[0101] 好ましくは、工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）のサイクルの少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または実質的に１００％について、マイクロキャリアはＭａｔｒｉｇｅｌおよびヒアルロン酸のうち一方または両方を含むマトリックスコーティング中にコートされている。]
[0102] 本発明による方法は、細胞培養物の連続的または間欠的な撹拌、たとえば約５から約２００ｒｐｍまで、約５から約１５０ｒｐｍまで、約５から約１００ｒｐｍまで、約３０ｒｐｍ以上、約５０ｒｐｍ以上、または約１００ｒｐｍ以上の撹拌を含むことができる。あるいは、本発明方法は静止培養を含むことができる。]
[0103] ある態様においては、細胞の分化を誘導するために撹拌速度または撹拌量の増大を採用でき、これに対し、より低い撹拌速度または撹拌量を採用して、有意の分化を誘導することなく多分化能性または多能性の細胞集団を拡張させることができる。]
[0104] 有意の分化を誘導することなく多分化能性または多能性の細胞集団を培養するためには、培養物を約５ｒｐｍから約１００ｒｐｍまで、約５ｒｐｍから約５０ｒｐｍまで、約５ｒｐｍから約４０ｒｐｍまで、約５ｒｐｍから約３０ｒｐｍまで、約５ｒｐｍから約２５ｒｐｍまで、約５ｒｐｍから約２０ｒｐｍまで、約５ｒｐｍから約１５ｒｐｍまで、約５ｒｐｍから約１０ｒｐｍまでで撹拌することができる。]
[0105] 有意の分化を誘導するするためには、培養物を約２５ｒｐｍから約２００ｒｐｍまでまたはそれ以上、たとえば約３０ｒｐｍから約２００ｒｐｍまでまたはそれ以上、約３５ｒｐｍから約２００ｒｐｍまでまたはそれ以上、約４０ｒｐｍから約２００ｒｐｍまでまた
はそれ以上、約４５ｒｐｍから約２００ｒｐｍまでまたはそれ以上、約５０ｒｐｍから約２００ｒｐｍまでまたはそれ以上、約７５ｒｐｍから約２００ｒｐｍまでまたはそれ以上、約１００ｒｐｍから約２００ｒｐｍまでまたはそれ以上で撹拌することができる。]
[0106] 細胞の有意の分化には、培養物中の少なくとも約１０％の細胞が分化している状態を含めることができる。あるいは、これは培養物中の約１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、または５０％のうち少なくともいずれかの細胞が分化している状態であってもよい。]
[0107] したがって、本発明方法は、細胞をそれらの多分化能性または多能性状態を維持したまま培養するために、方法の第１部を第１の速度または量で撹拌して実施し、続いて培養物中の細胞を分化させるために、第２の速度または量で撹拌して細胞を培養する第２部を実施することを含むことができる。第１の速度または量は、好ましくは第２の速度または量より小さい。したがって、本発明方法の第１部は多分化能性または多能性の細胞集団を拡張させることができ、本発明方法の第２部はそれらの細胞の一部または全部が内胚葉、外胚葉および中胚葉の系列へ分化するプロセスを開始することができる。]
[0108] 伝播したヒト胚性幹細胞は、好ましくは前記の継代回数の後、ヒト胚性幹細胞の少なくとも１つの生物活性を保持する。この生物活性は、（ｉ）多分化能性マーカーの発現；（ｉｉ）細胞生存率；（ｉｉｉ）正常な核型；（ｉｖ）内胚葉、外胚葉および中胚葉に分化する能力からなる群から選択できる。生物活性は、ＯＣＴ−４、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０およびＭａｂ８４からなる群から選択される多分化能性マーカーの発現を含むことができる。]
[0109] 本発明による方法は、好ましくはヒト胚性幹細胞を１：６以上、１：１０以上、１：１５以上、１：２０以上、または１：２６以上の分割比率で継代することを可能にする。
本発明による方法は、好ましくはヒト胚性幹細胞を２００万細胞／ｍｌ以上の体積生産量にまで伝播させることができる。]
[0110] 本発明による方法は、さらに、ヒト胚性幹細胞を粒子から分離する工程を含むことができる。
分化した細胞を生成するための方法も提供され、この方法は、本発明方法によりヒト胚性幹細胞を伝播させ、続いてヒト胚性幹細胞を分化させることを含む。]
[0111] 胚様体を生成するための方法も提供され、この方法は、本発明方法によりヒト胚性幹細胞を伝播させ、そしてヒト胚性幹細胞を培養して胚様体を生成させることを含む。
処置の必要な個体において疾患を処置する方法も提供され、この方法は、本発明方法によりヒト胚性幹細胞を伝播させ、分化した細胞または胚様体を生成し、そしてヒト胚性幹細胞、分化した細胞、または胚様体を個体に投与することを含む。]
[0112] 本発明の実施には、別途指示しない限り、一般的な化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡおよび免疫学の技術が採用され、それらは当業者がなしうる範囲内である。そのような技術は文献中に説明されている。たとえば下記を参照：J. Sambrook, E. F. Fritsch, and T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Books 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel, F. M. et al. (1995 and periodic supplements; Current Protocols in Molecular Biology, ch. 9, 13, and 16, John Wiley & Sons, New York, N.Y.); B. Roe, J. Crabtree, and A. Kahn, 1996, DNA Isolation and Sequencing: Essential Techniques, John Wiley & Sons; J. M. Polak and JamesO’D. McGee, 1990, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach,
Irl Press; D. M. J. Lilley and J. E. Dahlberg, 1992, Methodsof Enzymology: DNA
Structure Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology,
Academic Press; Using Antibodies : A Laboratory Manual : Portable Protocol NO. I by Edward Harlow, David Lane, Ed Harlow (1999, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN 0-87969-544-7); Antibodies : A Laboratory Manual by Ed Harlow (Editor), David Lane (Editor) (1988, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN 0-87969-314-2), 1855; and Lab Ref: A Handbook of Recipes, Reagents, and Other Reference Tools for Use at the Bench, Edited Jane Roskams and Linda Rodgers, 2002, Cold Spring Harbor Laboratory, ISBN 0-87969-630-3。これらの全般的テキストそれぞれを本明細書に援用する。]
[0113] 本発明には、前記の観点および好ましい特徴の組合わせが含まれる；ただし、そのような組合わせが明らかに許容できない場合または殊に避けるべきである場合を除く。
本明細書中で用いるセクション表題は組織化のためのものにすぎず、記載する主題を限定するものと解すべきではない。]
[0114] 本発明の観点および態様を、たとえば添付の図面を参照して以下に説明する。他の観点および態様は当業者に明らかであろう。本明細書に述べるすべての文献およびテキストを本明細書に援用する。]
[0115] 本発明の原理を説明する態様および実験を、添付の図面を参照して以下に述べる：]
図面の簡単な説明

[0116] 図１は、ｈＥＳＣを付着および成長させることができるマイクロキャリアを示す。３タイプのマイクロキャリアを用いた；ロッド形セルロースマイクロキャリア；小型球形の東ソー・親水性マイクロキャリア；ならびに大型球形ミクロ多孔質およびマクロ多孔質ｃａｒｂｏｓｅｅｄマイクロキャリア。図１Ａは、セルロースマイクロキャリアを示す。
図１は、ｈＥＳＣを付着および成長させることができるマイクロキャリアを示す。３タイプのマイクロキャリアを用いた；ロッド形セルロースマイクロキャリア；小型球形の東ソー・親水性マイクロキャリア；ならびに大型球形ミクロ多孔質およびマクロ多孔質ｃａｒｂｏｓｅｅｄマイクロキャリア。図１Ｂは、東ソー（親水性）マイクロキャリアを示す。
図１は、ｈＥＳＣを付着および成長させることができるマイクロキャリアを示す。３タイプのマイクロキャリアを用いた；ロッド形セルロースマイクロキャリア；小型球形の東ソー・親水性マイクロキャリア；ならびに大型球形ミクロ多孔質およびマクロ多孔質ｃａｒｂｏｓｅｅｄマイクロキャリア。図１Ｃは、ミクロ多孔質ｃａｒｂｏｓｅｅｄマイクロキャリアを示す。
図１は、ｈＥＳＣを付着および成長させることができるマイクロキャリアを示す。３タイプのマイクロキャリアを用いた；ロッド形セルロースマイクロキャリア；小型球形の東ソー・親水性マイクロキャリア；ならびに大型球形ミクロ多孔質およびマクロ多孔質ｃａｒｂｏｓｅｅｄマイクロキャリア。図１Ｄは、マクロ多孔質ｃａｒｂｏｓｅｅｄマイクロキャリアを示す。
図２は、ｈＥＳＣ培養物（ＨＥＳ−２およびＨＥＳ−３）の接種、継代および品質管理を示す。コロニー２Ｄ培養物を機械的解離または酵素解離によりマイクロキャリアへ移植し、そして両方法によりマイクロキャリア培養物をマイクロキャリアへ継代するワークフロー。
図３は、ｈＥＳＣ培養物（ＨＥＳ−２およびＨＥＳ−３）の接種、継代および品質管理を示す。マイクロキャリア培養物を元の２Ｄコロニー培養へ移植し、またマイクロキャリア培養物を連続継代し、続いて培養物を細胞数、生存率、多分化能性マーカーのフローサイトメトリー、組織学、核型、胚様体およびテラトーマ形成により特性分析するワークフロー。
図４は、本明細書に記載するマイクロキャリアがｈＥＳＣ培養物の凍結を支持しうることを示す。２ＤコロニーｈＥＳＣを凍結し、そして培養のためにマイクロキャリア上へｈＥＳＣを直接融解するワークフロー。マイクロキャリア培養物を再び凍結、融解および伝播させることもできる。
図５は、Ｋｎｏｃｋ Ｏｕｔ馴化培地および規定培地における成長速度および代謝を示す。馴化培地、ならびに２種類の市販の無血清培地ＳｔｅｍＰｒｏおよびｍＴｅＳＲ−１中で培養したマイクロキャリアの成長速度、グルコース、グルタミン、ラクテート、アンモニア、アミノ酸の代謝、およびｐＨの測定。
図６は、ｈＥＳＣ培養物（ＨＥＳ−３）の接種、継代および品質管理を示す。図６Ａは、機械的解離後の多分化能性マーカーの保持を示す：細胞を１００および５００ミクロンのメッシュに通し、そしてマイクロキャリアに接種。ｈＥＳＣを１００ミクロンのメッシュに通した後の多分化能性マーカーＯｃｔ−４、ＳＳＥＡ−４およびＴＲＡ−１−６０のＦＡＣＳ。
図６は、ｈＥＳＣ培養物（ＨＥＳ−３）の接種、継代および品質管理を示す。図６Ｂは、マイクロキャリア上の細胞をピペッティングにより機械的に分断し、続いて１：１０希釈して新たなマイクロキャリアに接種した後の多分化能性マーカーの保持を示す。ｈＥＳＣをピペッティングに続いて１：１０希釈してマイクロキャリア上へ付与した後の多分化能性マーカーＯｃｔ−４、ＳＳＥＡ−４およびＴＲＡ−１−６０のＦＡＣＳ。
図６は、ｈＥＳＣ培養物（ＨＥＳ−３）の接種、継代および品質管理を示す。図６Ｃは、対照の２Ｄコロニー培養を示す。
図６は、ｈＥＳＣ培養物（ＨＥＳ−３）の接種、継代および品質管理を示す。図６Ｄは、酵素解離後の多分化能性マーカーの保持を示す：ＴｒｙｐＬＥ処理したｈＥＳＣをマイクロキャリア上に接種する。７日目に求めた細胞数＝４．３Ｅ６細胞／ウェル。
図７は、ｈＥＳＣ培養物（ＨＥＳ−３）の接種、継代および品質管理を示す。２ＤコロニーのｈＥＳＣの７日目の培養物をｔｒｙｐＬＥ処理した後のものをマイクロキャリア培養物と対比。ｍａｔｒｉｇｅｌコートした静止セルロースマイクロキャリア上のｈＥＳＣ。図７Ａ．２Ｄコロニー培養物中およびマイクロキャリア上のｈＥＳＣの写真；０．８×および５×の倍率。
図７は、ｈＥＳＣ培養物（ＨＥＳ−３）の接種、継代および品質管理を示す。２ＤコロニーのｈＥＳＣの７日目の培養物をｔｒｙｐＬＥ処理した後のものをマイクロキャリア培養物と対比。ｍａｔｒｉｇｅｌコートした静止セルロースマイクロキャリア上のｈＥＳＣ。図７Ｂ．マイクロキャリア上の１および６日目のｈＥＳＣ；０．８×および５×の倍率。
図８は、ｈＥＳＣ培養物（ＨＥＳ−３）の接種、継代および品質管理を示す。ｍａｔｒｉｇｅｌコートした静止セルロースマイクロキャリア上のｈＥＳＣ。図８Ａ．継代５の後の多分化能性マーカーＯｃｔ−４、ＳＳＥＡ−４およびＴＲＡ−１−６０のＦＡＣＳ。
図８は、ｈＥＳＣ培養物（ＨＥＳ−３）の接種、継代および品質管理を示す。ｍａｔｒｉｇｅｌコートした静止セルロースマイクロキャリア上のｈＥＳＣ。図８Ｂ．継代９の後の多分化能性マーカーＯｃｔ−４、ＳＳＥＡ−４およびＴＲＡ−１−６０のＦＡＣＳ。
図８は、ｈＥＳＣ培養物（ＨＥＳ−３）の接種、継代および品質管理を示す。ｍａｔｒｉｇｅｌコートした静止セルロースマイクロキャリア上のｈＥＳＣ。図８Ｃおよび図８Ｄは、ｍａｔｒｉｇｅｌコートした静止セルロースマイクロキャリア上での継代４および６におけるｈＥＳＣの安定なＦＡＣＳを示す。核数は７００〜８００万／ウェルの範囲である。図８Ｃ．継代４の後の多分化能性マーカーＯｃｔ−４、ＳＳＥＡ−４およびＴＲＡ−１−６０のＦＡＣＳ。
図８は、ｈＥＳＣ培養物（ＨＥＳ−３）の接種、継代および品質管理を示す。ｍａｔｒｉｇｅｌコートした静止セルロースマイクロキャリア上のｈＥＳＣ。図８Ｃおよび図８Ｄは、ｍａｔｒｉｇｅｌコートした静止セルロースマイクロキャリア上での継代４および６におけるｈＥＳＣの安定なＦＡＣＳを示す。核数は７００〜８００万／ウェルの範囲である。図８Ｄ．継代６の後の多分化能性マーカーＯｃｔ−４、ＳＳＥＡ−４およびＴＲＡ−１−６０のＦＡＣＳ。図８Ｅ．対照２Ｄコロニー培養における多分化能性マーカーＯｃｔ−４、ＳＳＥＡ−４およびＴＲＡ−１−６０のＦＡＣＳ。核数は一般に２００〜４００万／ウェルにすぎない。
図９は、ｈＥＳＣ培養物（ＨＥＳ−３）の接種、継代および品質管理を示す。馴化培地およびＫＯ培地におけるマイクロキャリア培養物の位相差、ＤＡＰＩおよびＴＲＡ−１−６０染色による組織学的分析。ｈＥＳＣセルロースマイクロキャリア培養物の組織学的分析；継代３におけるＨＥＳ−３。列１：機械的解離、Ｍａｔｒｉｇｅｌコートしたマイクロキャリア、ＣＭ中、静止。列２：ｔｒｙｐＬＥ酵素収穫、Ｍａｔｒｉｇｅｌコートしたマイクロキャリア、ＣＭ中、静止。列３：そのままの（ｎａｔｉｖｅ）マイクロキャリア、ＣＭ懸濁液中、１００ｒｐｍ。列４：そのままのマイクロキャリア、ＣＭ中、静止。
図１０は、ｈＥＳＣ培養物（ＨＥＳ−３）の接種、継代および品質管理を示す。ｈＥＳＣをマイクロキャリアからｍａｔｒｉｇｅｌコートした６ｃｍ組織培養ペトリ皿へ再播種（ｒｅｐｌａｔｉｎｇ）；Ｐ５からＰ６へ。核数＝２０００万細胞／プレート。図１０Ａ．マイクロキャリア培養を６ｃｍペトリ皿上へ再播種した後の多分化能性マーカーＯｃｔ−４、ＳＳＥＡ−４およびＴＲＡ−１−６０のＦＡＣＳ。
図１０は、ｈＥＳＣ培養物（ＨＥＳ−３）の接種、継代および品質管理を示す。ｈＥＳＣをマイクロキャリアからｍａｔｒｉｇｅｌコートした６ｃｍ組織培養ペトリ皿へ再播種（ｒｅｐｌａｔｉｎｇ）；Ｐ５からＰ６へ。核数＝２０００万細胞／プレート。図１０Ｂ．再播種したｈＥＳＣの写真；０．８×および５×の倍率。
図１１は、ｈＥＳＣ培養物の凍結を示す。図１１Ａ．凍結ｈＥＳＣコロニーをマイクロキャリア上へ直接融解した後の多分化能性マーカーＯｃｔ−４、ＳＳＥＡ−４およびＴＲＡ−１−６０のＦＡＣＳ。７日目の核数＝４．２×１０Ｅ６細胞／ウェル、６ウェルプレート。
図１１は、ｈＥＳＣ培養物の凍結を示す。図１１Ｂ．凍結、融解、およびそれらの各細胞数で培養した後のマイクロキャリア上のｈＥＳＣの多分化能性マーカーＯｃｔ−４、ＳＳＥＡ−４およびＴＲＡ−１−６０のＦＡＣＳ。１４日目の核数＝７．１４×１０６細胞／ウェル。注釈：融解後の細胞死のため細胞をより長期間にわたって培養した。細胞は経時的に正常な成長速度を回復した。
図１２は、Ｋｎｏｃｋ Ｏｕｔ馴化培地における成長速度および代謝を示す。マイクロキャリア対−２Ｄコロニー培養におけるｈＥＳＣ成長速度の比較。マイクロキャリア対−２Ｄコロニー培養におけるｈＥＳＣ成長速度、およびそれらの関連ｐＨプロフィール。接種密度０．６７×１０Ｅ６細胞／ウェル（培地５ｍｌ中に２０ｍｇ／ｍｌのマイクロキャリア）。
図１３は、Ｋｎｏｃｋ Ｏｕｔ馴化培地における成長速度および代謝を示す。マイクロキャリア対−２Ｄコロニー培養におけるｈＥＳＣ代謝の比較。マイクロキャリア対−２Ｄコロニー培養におけるｈＥＳＣの１日当たりのグルコースおよびグルタミンの消費プロフィール、ならびにラクテートおよびアンモニアの産生プロフィール。
図１４は、Ｋｎｏｃｋ Ｏｕｔ馴化培地における成長速度および代謝を示す。マイクロキャリア対−２Ｄコロニー培養におけるｈＥＳＣ代謝の比較。マイクロキャリア対−２Ｄコロニー培養におけるｈＥＳＣの１日当たりのグルコースおよびグルタミンの比消費率プロフィール、ならびにラクテートおよびアンモニアの比産生率。
図１５は、Ｋｎｏｃｋ Ｏｕｔ馴化培地における成長速度および代謝を示す。２Ｄコロニー培養からとマイクロキャリア培養からの接種を比較。マイクロキャリア（２Ｄコロニーから、またはマイクロキャリアから接種）−対−２Ｄコロニー培養対照上でのｈＥＳＣの成長速度およびそれらの関連ｐＨプロフィール。細胞数／ウェル：接種密度５×１０Ｅ５細胞／ウェル。マイクロキャリアについての細胞数の方が高い。分割比率１：１８。倍増時間：マイクロキャリア＝３３時間。２Ｄコロニー培養＝５８時間。ｐＨ測定：３条件すべてについて、５日目後にｐＨがより大きく低下。
図１６は、Ｋｎｏｃｋ Ｏｕｔ馴化培地における成長速度および代謝を示す。マイクロキャリア対−２Ｄコロニー培養におけるｈＥＳＣ代謝の比較。マイクロキャリア対−２Ｄコロニー培養におけるｈＥＳＣ代謝の比較。マイクロキャリア（２Ｄコロニーから、またはマイクロキャリアから接種）−対−２Ｄコロニー培養におけるｈＥＳＣの１日当たりのグルコースおよびグルタミンの消費プロフィール、ならびにラクテートおよびアンモニアの産生プロフィール。
図１６は、Ｋｎｏｃｋ Ｏｕｔ馴化培地における成長速度および代謝を示す。マイクロキャリア対−２Ｄコロニー培養におけるｈＥＳＣ代謝の比較。マイクロキャリア対−２Ｄコロニー培養におけるｈＥＳＣ代謝の比較。マイクロキャリア（２Ｄコロニーから、またはマイクロキャリアから接種）−対−２Ｄコロニー培養におけるｈＥＳＣの１日当たりのグルコースおよびグルタミンの消費プロフィール、ならびにラクテートおよびアンモニアの産生プロフィール。
図１７は、Ｋｎｏｃｋ Ｏｕｔ馴化培地における成長速度および代謝を示す。マイクロキャリア対−２Ｄコロニー培養におけるｈＥＳＣ代謝の比較。マイクロキャリア（２Ｄコロニーから、またはマイクロキャリアから接種）−対−２Ｄコロニー培養におけるｈＥＳＣの１日当たりのグルコースおよびグルタミンの比消費率プロフィール、ならびにラクテートおよびアンモニアの比産生率。
図１７は、Ｋｎｏｃｋ Ｏｕｔ馴化培地における成長速度および代謝を示す。マイクロキャリア対−２Ｄコロニー培養におけるｈＥＳＣ代謝の比較。マイクロキャリア（２Ｄコロニーから、またはマイクロキャリアから接種）−対−２Ｄコロニー培養におけるｈＥＳＣの１日当たりのグルコースおよびグルタミンの比消費率プロフィール、ならびにラクテートおよびアンモニアの比産生率。
図１８は、無血清規定培地における成長速度および代謝を示す。ＳｔｅｍＰｒｏ無血清培地（継代５）およびｍＴｅＳＲ−１（継代４）中でのマイクロキャリアにおけるｈＥＳＣの多分化能性マーカーＯｃｔ−４、ＳＳＥＡ−４およびＴＲＡ−１−６０のＦＡＣＳ。
図１９は、キャリアのコーティングを示す。ヒアルロン酸、ヘパラン硫酸、デキストラン硫酸。ヘパラン硫酸、ヒアルロン酸、デキストラン硫酸、馴化培地、ＫＯ培地およびｍａｔｒｉｇｅｌでコートしたセルロースマイクロキャリアの７日目の細胞数。
図２０は、ｍａｔｒｉｇｅｌコートしたマイクロキャリア上のｈＥＳＣを１００ｒｐｍで撹拌したものを示す。１００ｒｐｍで撹拌したマイクロキャリア上のｈＥＳＣの１および６日目の写真；０．８×および５×の倍率。
図２１は、１００、１５０ｒｐｍにおける撹拌を示す。１００および１５０ｒｐｍで撹拌したｍａｔｒｉｇｅｌコートしたキャリアについてのＦＡＣＳ結果。注釈：両実験ともマイクロキャリア上のｈＥＳＣから継代した。図２１Ａ．１００ｒｐｍで撹拌したマイクロキャリア上のｈＥＳＣの多分化能性マーカーＯｃｔ−４、ＳＳＥＡ−４およびＴＲＡ−１−６０のＦＡＣＳ。
図２１は、１００、１５０ｒｐｍにおける撹拌を示す。１００および１５０ｒｐｍで撹拌したｍａｔｒｉｇｅｌコートしたキャリアについてのＦＡＣＳ結果。注釈：両実験ともマイクロキャリア上のｈＥＳＣから継代した。図２１Ｂ．１５０ｒｐｍで撹拌したマイクロキャリア上のｈＥＳＣの多分化能性マーカーＯｃｔ−４、ＳＳＥＡ−４およびＴＲＡ−１−６０のＦＡＣＳ。
図２２は、ｍａｔｒｉｇｅｌコートしたマイクロキャリア上のｈＥＳＣを１５０ｒｐｍで撹拌したものを示す。１５０ｒｐｍで撹拌したマイクロキャリア上のｈＥＳＣの１および６日目の写真；０．８×および５×の倍率。
図２３は１５０ｒｐｍで連続２週間撹拌した、ｍａｔｒｉｇｅｌコートしたキャリアについてのＦＡＣＳ結果を示す。１５０ｒｐｍで撹拌したマイクロキャリア上のｈＥＳＣの継代１および２における多分化能性マーカーＯｃｔ−４、ＳＳＥＡ−４およびＴＲＡ−１−６０のＦＡＣＳ。
図２４は、静止培養および１５０ｒｐｍ培養におけるマイクロキャリア上の継代２のＨＥＳ−２を示す。２Ｄコロニーおよび１５０ｒｐｍで撹拌したマイクロキャリア培養からのｈＥＳＣ（ＨＥＳ−２細胞系）の継代２における多分化能性マーカーＯｃｔ−４およびＴＲＡ−１−６０のＦＡＣＳ。
図２５は、２Ｄコロニー培養−対−静止、１００ｒｐｍおよび１５０ｒｐｍにおけるマイクロキャリア培養のＨＥＳ−２を示す。連続７継代にわたる２Ｄコロニー、静止状態、１００ｒｐｍおよび１５０ｒｐｍでの撹拌におけるマイクロキャリアで培養したｈＥＳＣの細胞数。
図２６は、２Ｄコロニー培養−対−静止および１００ｒｐｍにおけるマイクロキャリア培養のＨＥＳ−２を示す。図２６Ａ．２Ｄコロニーで培養したｈＥＳＣの多分化能性マーカーＯｃｔ−４、ＳＳＥＡ−４およびＴＲＡ−１−６０のＦＡＣＳ。
図２６は、２Ｄコロニー培養−対−静止および１００ｒｐｍにおけるマイクロキャリア培養のＨＥＳ−２を示す。図２６Ｂ．マイクロキャリアにおいて静止状態で培養したｈＥＳＣの多分化能性マーカーＯｃｔ−４、ＳＳＥＡ−４およびＴＲＡ−１−６０のＦＡＣＳ。
図２６は、２Ｄコロニー培養−対−静止および１００ｒｐｍにおけるマイクロキャリア培養のＨＥＳ−２を示す。図２６Ｃ．１００ｒｐｍで培養および撹拌したｈＥＳＣの多分化能性マーカーＯｃｔ−４、ＳＳＥＡ−４およびＴＲＡ−１−６０のＦＡＣＳ；継代５。
図２７は、キャリアの電荷を示す−ＤＥ５２、ＤＥ５３、Ｑ５３。図２７Ａ．セルロースマイクロキャリアＤＥ５２で培養したｈＥＳＣの多分化能性マーカーＯｃｔ−４、ＳＳＥＡ−４およびＴＲＡ−１−６０のＦＡＣＳ。図２７Ｂ．セルロースマイクロキャリアＤＥ５３で培養したｈＥＳＣの多分化能性マーカーＯｃｔ−４、ＳＳＥＡ−４およびＴＲＡ−１−６０のＦＡＣＳ。図２７Ｃ．セルロースマイクロキャリアＱＡ５２で培養したｈＥＳＣの多分化能性マーカーＯｃｔ−４、ＳＳＥＡ−４およびＴＲＡ−１−６０のＦＡＣＳ；継代３。
図２８は、キャリアのサイズおよび形状を示す−球形カーボンビーズ。カーボンｃａｒｂｏｓｅｅｄマイクロキャリア上のｈＥＳＣ。ＤＡＰＩおよびＴＲＡ−１−６０で染色した、５日目のカーボンマイクロキャリア上のマイクロキャリア培養物の組織学的分析。ＤＡＰＩおよびＴＲＡ−１−６０で染色した、７日目のカーボンマイクロキャリア上のマイクロキャリア培養物の組織学的分析。
図２９は、キャリアのサイズおよび形状を示す−球形カーボンビーズ。異なるコーティングをもつミクロ多孔質カーボン（ＳＨ１０１０）マイクロキャリア上でのＨＥＳ３の増殖を、２４ウェルプレート内で対照と比較。コートしていないＳＨ１０１０ミクロ多孔質カーボンマイクロキャリア上、フィブロネクチンまたはｍａｔｒｉｇｅｌでコートしたものにおけるｈＥＳＣの成長速度を、２Ｄコロニー対照と比較。
図３０は、キャリアのサイズおよび形状を示す−球形カーボンビーズ。染色ビーズ：３日目。ミクロ多孔質カーボンマイクロキャリア上でのｈＥＳＣ培養物の位相差、ＤＡＰＩおよびＴＲＡ−１−６０染色による組織学的分析；コートしていないかｍａｔｒｉｇｅｌまたはフィブロネクチンでコートしたマイクロキャリア上、３日目。
図３１は、キャリアのサイズおよび形状を示す−球形カーボンビーズ。染色ビーズ：５日目。ミクロ多孔質カーボンマイクロキャリア上でのｈＥＳＣ培養物の位相差、ＤＡＰＩおよびＴＲＡ−１−６０染色による組織学的分析；コートしていないかｍａｔｒｉｇｅｌまたはフィブロネクチンコートしたマイクロキャリア上、５日目。
図３２は、キャリアのサイズおよび形状を示す−球形カーボンビーズ。染色ビーズ：７日目。ミクロ多孔質カーボンマイクロキャリア上でのｈＥＳＣ培養物の位相差、ＤＡＰＩおよびＴＲＡ−１−６０染色による組織学的分析；コートしていないかｍａｔｒｉｇｅｌまたはフィブロネクチンコートしたマイクロキャリア上、７日目。
図３３は、キャリアのサイズおよび形状を示す−球形カーボンビーズ。７日目のＦｎコートしたカーボンビーズと対照の間のＯｃｔ−４、Ｔｒａ−１−６０およびＳＳＥＡ−４発現レベルのＦＡＣＳ分析および比較。２Ｄコロニー対照およびフィブロネクチンコートしたミクロ多孔質カーボンマイクロキャリア上で培養したｈＥＳＣの多分化能性マーカーＯｃｔ−４、ＳＳＥＡ−４およびＴＲＡ−１−６０のＦＡＣＳ。
図３４は、キャリアのサイズおよび形状を示す−球形カーボンビーズ。Ｆｎコートしたカーボンビーズ−対−対照におけるＯｃｔ−４ ＧＦＰＨＥＳ２。図３４Ａ．２Ｄコロニー対照およびフィブロネクチンコートしたミクロ多孔質カーボンマイクロキャリア上でのｈＥＳＣの成長。生存率＞９５％。
図３４は、キャリアのサイズおよび形状を示す−球形カーボンビーズ。Ｆｎコートしたカーボンビーズ−対−対照におけるＯｃｔ−４ ＧＦＰ ＨＥＳ２。図３４Ｂ．両条件における多分化能性マーカーＯｃｔ−４のＦＡＣＳ。
図３５は、キャリアのサイズおよび形状を示す−球形カーボンビーズ。ＳＨ１０１０およびＳＭ１０１０マイクロキャリア対−２Ｄコロニー対照（ＯＣＤ）の比較。２Ｄコロニー対照ならびにフィブロネクチンコートしたマクロ多孔質（ＳＨ１０１０）およびミクロ多孔質（ＳＭ１０１０）カーボンマイクロキャリア上でのｈＥＳＣの成長。
図３６は、キャリアのサイズおよび形状を示す−球形カーボンビーズ。フィブロネクチンコートしたマクロ多孔質カーボンマイクロキャリア上で培養したｈＥＳＣの多分化能性マーカーＯｃｔ−４およびＴＲＡ−１−６０のＦＡＣＳ。
図３６は、キャリアのサイズおよび形状を示す−球形カーボンビーズ。フィブロネクチンコートしたマクロ多孔質カーボンマイクロキャリア上で培養したｈＥＳＣの多分化能性マーカーＯｃｔ−４およびＴＲＡ−１−６０のＦＡＣＳ。
図３７は、キャリアのサイズおよび形状を示す−球形カーボンビーズ。ＤＡＰＩ、ファロイジン（Ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ）およびＴＲＡ−１−６０で染色したマクロ多孔質およびミクロ多孔質カーボンマイクロキャリア上のｈＥＳＣ培養物の組織学的分析。
図３８は、キャリアのサイズおよび形状を示す−球形カーボンビーズ。１５日目のマイクロキャリア培養物。ｍａｔｒｉｇｅｌコートしたマクロ多孔質カーボンマイクロキャリア上での１５日間にわたるｈＥＳＣの成長を７日間にわたる２Ｄコロニー対照と比較。
図３９は、キャリアのサイズおよび形状を示す−球形カーボンビーズ。フィブロネクチンコートしたマクロ多孔質カーボンマイクロキャリア上で１５日間にわたって培養したｈＥＳＣの多分化能性マーカーＯｃｔ−４およびＴＲＡ−１−６０のＦＡＣＳ。
図３９は、キャリアのサイズおよび形状を示す−球形カーボンビーズ。フィブロネクチンコートしたマクロ多孔質カーボンマイクロキャリア上で１５日間にわたって培養したｈＥＳＣの多分化能性マーカーＯｃｔ−４およびＴＲＡ−１−６０のＦＡＣＳ。
図４０は、キャリアのサイズおよび形状を示す−球形カーボンビーズ。馴化培地の供給を増加。２倍体積−対−１倍体積を供給したカーボンマイクロキャリア上でのｈＥＳＣの成長を２Ｄコロニー対照と比較。
図４１は、キャリアのサイズおよび形状を示す−球形カーボンビーズ。マクロ多孔質カーボンマイクロキャリア上で２倍体積を供給して培養したｈＥＳＣの多分化能性マーカーＯｃｔ−４およびＴＲＡ−１−６０のＦＡＣＳ。
図４１は、キャリアのサイズおよび形状を示す−球形カーボンビーズ。マクロ多孔質カーボンマイクロキャリア上で２倍体積を供給して培養したｈＥＳＣの多分化能性マーカーＯｃｔ−４およびＴＲＡ−１−６０のＦＡＣＳ。
図４２は、キャリアのサイズおよび形状を示す−球形カーボンビーズ。ＤＡＰＩ、ファロイジンおよびＴＲＡ−１−６０で染色したマクロ多孔質カーボンマイクロキャリア上でのｈＥＳＣ培養物の組織学的分析。
図４３は、キャリアのサイズおよび形状を示す−球形カーボンビーズ。マクロ多孔質マイクロキャリア上で成長させたＨＥＳ２ＧＦＰ細胞系を２Ｄコロニー対照と対比。図４３Ａおよび４３Ｂ．マクロ多孔質マイクロキャリア上で成長させたもうひとつの細胞系（ＨＥＳ−２）についての二重実験を２Ｄコロニー対照と対比。
図４３は、キャリアのサイズおよび形状を示す−球形カーボンビーズ。マクロ多孔質マイクロキャリア上で成長させたＨＥＳ２ ＧＦＰ細胞系を２Ｄコロニー対照と対比。図４３Ａおよび４３Ｂ．マクロ多孔質マイクロキャリア上で成長させたもうひとつの細胞系（ＨＥＳ−２）についての二重実験を２Ｄコロニー対照と対比。
図４４は、キャリアのサイズおよび形状を示す−球形カーボンビーズ。マクロ多孔質カーボンマイクロキャリア上で培養したＨＥＳ−２細胞系の７日後の多分化能性マーカーＯｃｔ−４およびＴＲＡ−１−６０のＦＡＣＳ。
図４４は、キャリアのサイズおよび形状を示す−球形カーボンビーズ。マクロ多孔質カーボンマイクロキャリア上で培養したＨＥＳ−２細胞系の７日後の多分化能性マーカーＯｃｔ−４およびＴＲＡ−１−６０のＦＡＣＳ。
図４５は、キャリアのサイズおよび形状を示す−球形カーボンビーズ。２日毎に蛍光顕微鏡下でイメージを撮影；４×の倍率。画像は、マイクロキャリア上で培養したＧＦＰ細胞が１日目から７日目まで成長したことを示す。マクロ多孔質カーボンマイクロキャリア上で７日間にわたって成長している蛍光ＨＥＳ−２ ＧＦＰ細胞系の写真。
図４６は、キャリアのサイズおよび形状を示す−球形カーボンビーズ。１ｍｍのマクロ多孔質ビーズを２Ｄ対照と対比。培養を１２日目まで延長すると、細胞密度が１．２×１０ｅ６細胞にまで増大した。図４６Ａ．静止、高速混合（３０分毎）および低速混合（２時間毎）したｍａｔｒｉｇｅｌまたはフィブロネクチンでコートしたカーボンマイクロキャリア上に接種した後のｈＥＳＣの成長を、ｍａｔｒｉｇｅｌまたはフィブロネクチンでコートした２Ｄコロニー対照と対比。Ｈｉｇｈ ｍｉｘ（高速混合）−３０分毎。Ｌｏｗ ｍｉｘ（２時間毎）−２時間毎。接種中の混合は、１ｍｍビーズ上での細胞成長を低下させない。これらの条件下での多分化能性マーカーＯｃｔ−４、ＳＳＥＡ−４およびＴＲＡ−１−６０のＦＡＣＳ。
図４６は、キャリアのサイズおよび形状を示す−球形カーボンビーズ。１ｍｍのマクロ多孔質ビーズを２Ｄ対照と対比。培養を１２日目まで延長すると、細胞密度が１．２×１０ｅ６細胞にまで増大した。図４６Ｂ．多分化能性マーカーＯｃｔ−４、ＳＳＥＡ−４およびＴＲＡ−１−６０の発現は安定している。
図４７は、マイクロキャリア上の共培養およびフィーダーを示す。図４７Ａ．Ｃｙｔｏｄｅｘ上のフィーダーとセルロースマイクロキャリア上のｈＥＳＣとの写真。
図４７は、マイクロキャリア上の共培養およびフィーダーを示す。図４７Ｂ．ポリリジンコートした東ソー上のフィーダーとセルロースマイクロキャリア上のｈＥＳＣとの写真。
図４８は、マイクロキャリア上の共培養およびフィーダーを示す。図４８Ａ．Ｃｙｔｏｄｅｘ上のフィーダーとセルロースマイクロキャリア上のｈＥＳＣとの共培養物の多分化能性マーカーＯｃｔ−４、ＳＳＥＡ−４およびＴＲＡ−１−６０のＦＡＣＳ。
図４８は、マイクロキャリア上の共培養およびフィーダーを示す。図４８Ｂ．ポリリジンコートした東ソー上のフィーダーとセルロースマイクロキャリア上のｈＥＳＣとの共培養の多分化能性マーカーＯｃｔ−４、ＳＳＥＡ−４およびＴＲＡ−１−６０のＦＡＣＳ。
図４９は、スピナー培養を示す。マイクロキャリア上での５０ｍｌスピナー培養におけるｈＥＳＣの指数成長プロフィールを、静止マイクロキャリア培養および２Ｄコロニー培養と比較。
図５０は、継代６における核型が正常である特性分析データを示す。セルロースマイクロキャリア上で６回連続継代した後（２４細胞倍増と同等）のＨＥＳ−２およびＨＥＳ−３細胞系の核型は正常。
図５１は、セルロースマイクロキャリア上と２Ｄコロニー培養とのｈＥＳＣ成長の比較を示す。
図５２は、ＭａｔｒｉｇｅｌコートしたＤＥ５３キャリア上でのｈＥＳＣ培養の継代１５および１６におけるＯｃｔ４、ＳＳＥＡ４およびＴＲＡ−１−６０の発現を示す。
図５３は、ＭａｔｒｉｇｅｌコートしたＤＥ５３キャリア上でのｈＥＳＣ培養の継代２１〜２３における、および継代２３を２Ｄコロニー培養へ再播種した後の、Ｏｃｔ４、ＳＳＥＡ４およびＴＲＡ−１−６０の発現を示す。
図５４は、ＨＥＳ−３のマイクロキャリア培養が継代２２および２５に至るまで正常な４６ＸＸ核型を保持していることを示す。
図５５は、ＨＥＳ−２のマイクロキャリア培養が継代１４に至るまで正常な４６ＸＸ核型を保持していることを示す。
図５６は、継代３および２７におけるマイクロキャリア培養からのｈＥＳＣが胚様体に分化しており、内胚葉（アミラーゼおよびＧＡＴＡ６）、外胚葉（ケラチンおよびニューロフィラメントＮＦ）および中胚葉（ＭＳＸ１およびＨＡＮＤ１）の遺伝子により表わされる３胚葉の細胞を形成できたことを示す。
図５７（Ａ〜Ｃ）は、図５６からの３胚葉の細胞についてテラトーマが形成されたことを示す。
図５８は、マイクロキャリア上でのｈＥＳＣの成長を示す；ｍＴｅＳＲ１−対−ＳｔｅｍＰＲＯ培地。
図５９は、マイクロキャリア上でのｈＥＳＣの倍増時間の比較を示す；ｍＴｅＳＲ１−対−ＳｔｅｍＰＲＯ培地。
図６０は、ｈＥＳＣマイクロキャリア培養について規定培地（ｍＴｅＳＲ１−対−ＳｔｅｍＰＲＯ）における代謝の比較を示す。
図６１は、ｈＥＳＣマイクロキャリア培養について規定培地（ｍＴｅＳＲ１−対−ＳｔｅｍＰＲＯ）における代謝の比較を示す。
図６２は、ｈＥＳＣマイクロキャリア培養について規定培地（ｍＴｅＳＲ１−対−ＳｔｅｍＰＲＯ）におけるイオンおよびオスモル濃度（ｏｓｍｏｌａｒｉｔｙ）の比較を示す。
図６３は、ｈＥＳＣマイクロキャリア培養について規定培地（ｍＴｅＳＲ１−対−ＳｔｅｍＰＲＯ）におけるアミノ酸分析を示す。
図６４は、下記を示す：（ａ）ｍＴｅＳＲ１中でのｈＥＳＣマイクロキャリア培養についてのアミノ酸消費率；（ｂ）ＳｔｅｍＰＲＯ中でのｈＥＳＣマイクロキャリア培養についてのアミノ酸消費率。
図６５は、ｍＴｅＳＲ１およびＳｔｅｍＰＲＯ中でのｈＥＳＣマイクロキャリア培養についてｐＨおよび細胞総数を示す。
図６６は、ｍＴｅＳＲ１およびＳｔｅｍＰＲＯ中でのｈＥＳＣマイクロキャリア培養について成長速度を示す。
図６７は、ＨＥＳ−３細胞の成長を示す。静止マイクロキャリア培養、２０ｒｐｍ撹拌での５０ｍｌスピナーフラスコ、単層培養、および２５ｒｐｍ撹拌での５０ｍｌスピナーフラスコの比較。
図６８は、マイクロキャリアスピナーフラスコ培養からの馴化培地の代謝産物分析を示す。
図６９は、マイクロキャリアスピナーフラスコ培養からの馴化培地中における代謝産物の比産生率を示す。
図７０は、マイクロキャリアスピナーフラスコ培養からのｐＨおよびオスモル濃度（ｏｓｍｏｌａｒｉｔｙ）状態を示す。
図７１は、マイクロキャリアスピナーフラスコ培養におけるＯｃｔ４、ＳＳＥＡ４およびＴＲＡ−１−６０の発現を示す。多分化能性マーカーＯｃｔ４、ＳＳＥＡ４およびＴＲＡ−１−６０は、３および４日目に高い状態を保持している。
図７２は、マイクロキャリアスピナーフラスコ培養におけるｈＥＳＣの形態が、４および５日目にマイクロキャリア上で緻密な集合体のままであることを示す。
図７３は、マイクロキャリアスピナーフラスコ培養におけるＨＥＳ−２の成長を示す。
図７４は、マイクロキャリアスピナーフラスコ培養における多分化能性マーカーＯｃｔ４、ＳＳＥＡ４およびＴＲＡ−１−６０の発現が、スピナー培養の開始時に２Ｄコロニー対照と同等であったことを示す。
図７５は、マイクロキャリアスピナーフラスコ培養における多分化能性マーカーＯｃｔ４、ＳＳＥＡ４およびＴＲＡ−１−６０の発現が、ピーク細胞密度に達した５および７日目に高い状態を維持しており、対照静止培養と同等であったことを示す。
図７６は、マイクロキャリアスピナーフラスコ培養におけるｈＥＳＣが、５および７日目にマイクロキャリアの周りに大きな細胞集合体を形成していることを示す。
図７７は、１００ｍｌのスピナーフラスコにおける３５０万細胞／ｍｌの密度が、それぞれ２００万細胞／ｍｌを含む臓器培養皿（ＯＣＤ）１７５個でｈＥＳＣを生成するのと同等であることを示す。
図７８は、Ｃｙｔｏｄｅｘ上のマウスフィーダー、およびフィーダーでコートしたポリリジンコートした東ソー・ビーズを、セルロースＤＥ５３マイクロキャリア上のｈＥＳＣと一緒に共培養して成長した、セルロースマイクロキャリア上のｈＥＳＣを示す。
図７９は、ｈＥＳＣと、それぞれＣｙｔｏｄｅｘ ３、東ソーおよびＤＥ５３マイクロキャリア上のフィーダー細胞との３種類の共培養物について、継代１におけるＯｃｔ４、ＳＳＥＡ４およびＴＲＡ−１−６０を示す。
図８０は、Ｃｙｔｏｄｅｘ ３、東ソーおよびＤＥ５３マイクロキャリア上との３種類の異なる共培養物において、継代２におけるＯｃｔ４、ＳＳＥＡ４およびＴＲＡ−１−６０の強い発現を示す；これらはｍａｔｒｉｇｅｌコートしたマイクロキャリアを用いた対照と同等またはより良好である（図７９を参照）。
図８１は、ＭａｔｒｉｇｅｌコートしたＤＥ５３マイクロキャリア上のｈＥＳＣからのＯｃｔ４およびＴＲＡ−１−６０の発現を示す。
図８２は、東ソー・マイクロキャリア（１０μｍおよび６５μｍ）上での継代Ｐ１における多分化能性マーカーＯｃｔ４、ＳＳＥＡ４およびＴＲＡ−１−６０の発現を示す；４ｍｇプロタミン（１０μｍ）、０．２ｍｇプロタミン＋Ｍａｔｒｉｇｅｌ（１０μｍ）、４ｍｇプロタミン＋Ｍａｔｒｉｇｅｌ（１０μｍ）、４ｍｇプロタミン＋Ｍａｔｒｉｇｅｌ（６５μｍ）を含む。
図８３は、ポリリジン 東ソー・ビーズを示す；ｍａｔｒｉｇｅｌコーティングを含まないものと含むもの、原液と３０倍希釈濃度。
図８４は、プロタミン 東ソー・ビーズを示す；ｍａｔｒｉｇｅｌコーティングを含まないものと含むもの、原液と３０倍希釈濃度のもの。
図８５は、ポリリジンコートおよびプロタミンコートした両方の東ソー・ビーズ（６５ミクロン）の細胞数を示す；ｍａｔｒｉｇｅｌを含むものと含まないもの、４継代について。
図８６は、ポリリジン 東ソー・マイクロキャリア上のｈＥＳＣについて、多分化能性マーカーＯｃｔ４およびＴＲＡ−１−６０の発現を示す；ｍａｔｒｉｇｅｌを含まないものと含むもの、継代１。
図８７は、プロタミン 東ソー・マイクロキャリア上のｈＥＳＣについて、多分化能性マーカーＯｃｔ４およびＴＲＡ−１−６０の発現を示す；ｍａｔｒｉｇｅｌを含まないものと含むもの、継代１。
図８８は、ｍａｔｒｉｇｅｌコートしたポリリジン 東ソー・マイクロキャリア上のｈＥＳＣについて、継代２における多分化能性マーカーＴＲＡ−１−６０の発現を示す。
図８９は、ｍａｔｒｉｇｅｌコートしたプロタミン 東ソー・マイクロキャリア上のｈＥＳＣの、継代２における多分化能性マーカーＴＲＡ−１−６０の発現を示す。
図９０は、ｍａｔｒｉｇｅｌコートしたポリリジン 東ソー・マイクロキャリア上のｈＥＳＣの、継代３における多分化能性マーカーＴＲＡ−１−６０の発現を示す。
図９１は、ｍａｔｒｉｇｅｌコートしたプロタミン 東ソー・マイクロキャリア上のｈＥＳＣの、継代３における多分化能性マーカーＴＲＡ−１−６０の発現を示す。
図９２は、ｍａｔｒｉｇｅｌでコートした大型ポリリジンおよびプロタミン 東ソー・ビーズ上で、継代４のｈＥＳＣが未分化集合体を形成し続けることを示す。
図９３は、ｍａｔｒｉｇｅｌコートしたポリリジンおよびプロタミン−マイクロキャリア上での、継代４におけるｈＥＳＣの多分化能性マーカーＯｃｔ４およびＴＲＡ−１−６０の継続発現を示す。
図９４は、ｍａｔｒｉｇｅｌコーティングをもつポリリジンおよびプロタミン 東ソー・ビーズ上で５継代成長させたｈＥＳＣの安定な細胞数を示す。
図９５は、ｍａｔｒｉｇｅｌコーティングを含むポリリジンおよびプロタミン 東ソー・ビーズ上での、継代５におけるｈＥＳＣの多分化能性マーカーＯｃｔ４およびＴＲＡ−１−６０の継続発現を示す。
図９６は、ポリリジンおよびプロタミン 東ソー・マイクロキャリア上の、継代５におけるｈＥＳＣ集合体を示す。
図９７は、マイクロキャリア濃度を１００万細胞当たり４８，０００ビーズに最適化すると、Ｍａｔｒｉｇｅｌコートしたポリリジン 東ソー・マイクロキャリアについて多分化能性マーカーＯｃｔ４およびＴＲＡ−１−６０の発現が継代６と７の間でより高いレベルに回復したことを示す。
図９８は、マイクロキャリア濃度を１００万細胞当たり４８，０００ビーズに最適化すると、Ｍａｔｒｉｇｅｌコートしたプロタミン 東ソー・マイクロキャリアについて多分化能性マーカーＯｃｔ４およびＴＲＡ−１−６０の発現が継代６と７の間でより高いレベルに回復したことを示す。
図９９は、継代５まで、ｍａｔｒｉｇｅｌコートしたＣｙｔｏｄｅｘ ３マイクロキャリアは撹拌（１００および１２０ｒｐｍの両方）および非撹拌の両方の条件でｈＥＳＣの成長を可能にしたことを示す。
図１００は、継代７まで、撹拌しないｍａｔｒｉｇｅｌコートＣｙｔｏｄｅｘ ３マイクロキャリア上でｈＥＳＣが生存し続け、継代９にまで成長したことを示す。
図１０１は、ｍａｔｒｉｇｅｌを含まないＣｙｔｏｄｅｘ ３マイクロキャリア上をｈＥＳＣがほとんど覆っていないことを示す。
図１０２は、１００ｒｐｍで撹拌したｍａｔｒｉｇｅｌを含まないＣｙｔｏｄｅｘ ３マイクロキャリア上におけるｈＥＳＣの大きなクラスターを示す。
図１０３は、撹拌しない条件におけるｍａｔｒｉｇｅｌコートしたＣｙｔｏｄｅｘ ３マイクロキャリア上のｈＥＳＣの集密成長を示す。
図１０４は、撹拌条件（１００ｒｐｍ）におけるｍａｔｒｉｇｅｌコートしたＣｙｔｏｄｅｘ ３マイクロキャリア上のｈＥＳＣの集密成長を示す。
図１０５は、ｍａｔｒｉｇｅｌを含まないＣｙｔｏｄｅｘ ３上で、継代３により多分化能性マーカーＯｃｔ４およびＴＲＡ−１−６０の発現がダウンレギュレーションされることを示す。
図１０６は、ｍａｔｒｉｇｅｌコートしたＣｙｔｏｄｅｘ ３マイクロキャリアについて、継代９においてすらＯｃｔ４、ＳＳＥＡ４およびＴＲＡ−１−６０が強く発現することを示す。
図１０７は、ｍａｔｒｉｇｅｌを含まないＣｙｔｏｄｅｘ ３上で撹拌条件において成長したｈＥＳＣは、継代３により多分化能性マーカーがダウンレギュレーションされることを示す。
図１０８は、ｍａｔｒｉｇｅｌコーティングを含むＣｙｔｏｄｅｘ ３上で撹拌条件において成長したｈＥＳＣは、継代Ｐ３により多分化能性マーカーＯｃｔ４およびＴＲＡ−１−６０がダウンレギュレーションされることを示す。
図１０９は、継代１３により、ｍａｔｒｉｇｅｌコートしたＣｙｔｏｄｅｘ ３マイクロキャリアが静止条件ではＯｃｔ４、ＳＳＥＡ４およびＴＲＡ−１−６０を強く発現するｈＥＳＣをなお支持することを示し、一方、フィブロネクチンおよびラミニンでコートしたＣｙｔｏｄｅｘ ３は継代６において多分化能性マーカーの発現の低下を示した。
図１１０は、ｈＥＳＣの核型判定が、ｍａｔｒｉｇｅｌでコートしたＣｙｔｏｄｅｘ ３上において１１継代後に正常な４６ＸＸ核型を示したことを示す。
図１１１は、Ｃｙｔｏｄｅｘ １上で成長しているｈＥＳＣを示す；ｍａｔｒｉｇｅｌコーティングを含むものと含まないもの。
図１１２は、Ｈｉｌｌｅｘマイクロキャリア上で成長しているｈＥＳＣを示す；ｍａｔｒｉｇｅｌコーティングを含むものと含まないもの。
図１１３は、ＨｉｌｌｅｘおよびＣｙｔｏｄｅｘ １マイクロキャリア上のｈＥＳＣの細胞数を示す；ｍａｔｒｉｇｅｌコーティングを含むものと含まないもの、撹拌するものと撹拌しないもの、３つの継代後。
図１１４は、ＨｉｌｌｅｘおよびＣｙｔｏｄｅｘ １マイクロキャリアの静止（撹拌しない）培養を継代９まで継代しうることを示す；ｍａｔｒｉｇｅｌを含むものと含まないもの。
図１１５は、Ｃｙｔｏｄｅｘ １およびＨｉｌｌｅｘマイクロキャリア上で成長したｈＥＳＣの平均細胞濃度および平均拡張倍率を示す；ｍａｔｒｉｇｅｌを含むものと含まないもの。
図１１６は、ＭａｔｒｉｇｅｌコートしたＣｙｔｏｄｅｘ １およびＨｉｌｌｅｘマイクロキャリアが、コートしていないマイクロキャリアより集密状態であることを示す。Ｈｉｌｌｅｘマイクロキャリアは、培地からのフェノールレッドで赤色に着色し続ける。
図１１７は、Ｃｙｔｏｄｅｘ １およびＨｉｌｌｅｘについて、ｈＥＳＣ多分化能性マーカー（Ｏｃｔ４、ＴＲＡ−１−６０およびｍＡｂ８４）の代表的なプロットを示す；Ｍａｔｒｉｇｅｌを含むものと含まないもの、継代６。
図１１８は、Ｃｙｔｏｄｅｘ １およびＨｉｌｌｅｘについて、種々の継代における（２〜１０継代）３種類の多分化能性マーカーＯｃｔ４、ＴＲＡ−１−６０およびｍＡｂ８４のＦＡＣＳ分析を示す；Ｍａｔｒｉｇｅｌを含むものと含まないもの。
図１１９は、継代１３において、ｍａｔｒｉｇｅｌを含むＣｙｔｏｄｅｘ １上で培養したｈＥＳＣが３種類の多分化能性マーカーを発現することを示す。
図１２０は、Ｃｙｔｏｄｅｘ １およびＨｉｌｌｅｘについて、ｈＥＳＣ核型が正常なことを示す；Ｍａｔｒｉｇｅｌを含むものと含まないもの、継代７。
図１２１は、コンドロイチン硫酸、ヘパリンおよびヒアルロン酸のコーティングを含むＤＥ５３セルロースマイクロキャリアのｈＥＳＣ培養物について、継代Ｐ１における多分化能性マーカーＯｃｔ４、ＳＳＥＡ４およびＴＲＡ−１−６０の発現を示す。
図１２２は、ＫＯ培地のコーティングを含むｈＥＳＣ ＤＥ５３セルロースマイクロキャリア培養物について、継代Ｐ１における多分化能性マーカーＯｃｔ４、ＳＳＥＡ４およびＴＲＡ−１−６０の発現を示す。
図１２３は、ヒアルロン酸（ＨＡ）＋ヘパリン塩（ＨＳ）で、およびフィブロネクチン＋ＨＳ＋ＨＡでコートした、ＤＥ−５３セルロースマイクロキャリアを示す。
図１２４は、ヒアルロン酸（ＨＡ）で、およびフィブロネクチン＋ＨＡでコートした、ＤＥ−５３セルロースマイクロキャリアを示す。
図１２５は、フィブロネクチン（ＦＮ）；フィブロネクチン＋ＨＳ＋ＨＡ；およびＨＡ＋ＨＳでコートしたＤＥ５３について、継代１によりＴＲＡ−１−６０がダウンレギュレーションされることを示す。
図１２６は、ＨＡ＋ＦＮ；およびＨＡでコートしたＤＥ５３について、継代１によりＴＲＡ−１−６０がダウンレギュレーションされることを示す。
図１２７は、ＨＳ、ＦＮ、ＨＳ、Ｉ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲンおよびラミニンの組合わせでコートしたＤＥ５３について、継代１〜３における細胞数を示す。
図１２８は、セルロースＤＥ−５３マイクロキャリア上にコートしたＥＣＭとＨＡの種々の組合わせについて、ｈＥＳＣの形態を示す。
図１２９は、セルロースＤＥ−５３マイクロキャリア上にコートしたＥＣＭとＨＳの種々の組合わせについて、ｈＥＳＣの形態を示す。
図１３０は、ＨＡコートしたＤＥ−５３およびＨＳコートしたＤＥ−５３上のｈＥＳＣの形態を示す。
図１３１は、ＨＡとＩ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、ラミニンおよびフィブロネクチンとの組合わせを含むマイクロキャリア上のｈＥＳＣの形態が、他のＥＣＭ組合わせと比較して緻密な細胞集合体を形成することを示す。
図１３２は、ＨＡ＋ＣＯＬ１＋ＦＮおよびＨＡ＋ＣＯＬ４＋ＦＮのＤＥ−５３マトリックスコーティングについて、３継代後に多分化能性マーカーＯｃｔ４、ＳＳＥＡ４およびＴＲＡ−１−６０が発現し続けることを示す。
図１３３は、ＨＡ＋ＣＯＬ１＋ＦＮ＋ＬＭおよびＨＡ＋ＣＯＬ４＋ＦＮ＋ＬＭのＤＥ−５３マトリックスコーティングについて、３継代後に多分化能性マーカーＯｃｔ４、ＳＳＥＡ４およびＴＲＡ−１−６０が発現し続けることを示す。
図１３４は、ＨＳ＋ＣＯＬ１＋ＦＮおよびＨＳ＋ＣＯＬ４＋ＦＮのＤＥ−５３マトリックスコーティングについて、３継代後に多分化能性マーカーＯｃｔ４、ＳＳＥＡ４およびＴＲＡ−１−６０が発現し続けることを示す。
図１３５は、ＨＳ＋ＣＯＬ１＋ＦＮ＋ＬＭおよびＨＳ＋ＣＯＬ４＋ＦＮ＋ＬＭのＤＥ−５３マトリックスコーティングについて、３継代後に多分化能性マーカーＯｃｔ４、ＳＳＥＡ４およびＴＲＡ−１−６０が発現し続けることを示す。
図１３６は、ＨＡコートしたＤＥ５３セルロースマイクロキャリア上で活発なｈＥＳＣ成長が継続することを示す。
図１３７は、ＨＡコートしたＤＥ５３セルロースマイクロキャリア上で多分化能性マーカーＯｃｔ４およびＴＲＡ−１−６０の強い発現が継続することを示す。
図１３８は、ＨＡコートしたＤＥ５３セルロースマイクロキャリア上で、継代８および９においてＴＲＡ−１−６０の高い発現が継続することを示す。
図１３９は、ＨＡコートしたＤＥ−５３セルロースマイクロキャリア上で継代６において成長した緻密なｈＥＳＣ集合体の形態を示す；２つの異なる倍率。
図１４０は、ｈＥＳＣ懸濁培養に適したマイクロキャリアの模式図を示す。
図１４１、表１は、ＴｅＳＲ１およびＳｔｅｍＰＲＯ培地中でｈＥＳＣにより消費および産生されたアミノ酸を示す。
図１４２、表２は、ＴｅＳＲ１およびＳｔｅｍＰＲＯ無血清培地中でｈＥＳＣにより消費および産生されたアミノ酸の個々のレベルに関する詳細な情報を示す。
図１４３、表３は、Ｃｙｔｏｄｅｘ ３および東ソー・球形マイクロキャリア上のフィーダー細胞との共培養、ならびにロッド形セルロースＤＥ５３マイクロキャリア上との共培養における、継代０および継代１におけるｈＥＳＣの細胞密度を示す。
図１４４、表４は、３種類の共培養物中のｈＥＳＣの細胞数が、ｍａｔｒｉｇｅｌコートしたマイクロキャリア上の対照と比較して約２倍高いことを示す。
図１４５、表５は、小型（１０ミクロン）および大型（６５ミクロン）両方の東ソー・マイクロキャリアが、継代０および継代１においてｈＥＳＣの成長を支持したことを示す；ｍａｔｒｉｇｅｌを含むものと含まないもの。
図１４６、表６は、ポリリジンおよびプロタミンコートした両方の東ソー・ビーズ（６５ミクロン）の細胞数を示す；ｍａｔｒｉｇｅｌを含むものと含まないもの、４継代について。
図１４７、表７は、成長したｈＥＳＣの細胞数がＣｙｔｏｄｅｘ ３マイクロキャリア上で比較的安定であることを示す；ｍａｔｒｉｇｅｌでコートしたものとｍａｔｒｉｇｅｌを含まないもの、非撹拌条件および撹拌条件で３継代培養。
図１４８、表８は、セルロースマイクロキャリア上で成長したｈＥＳＣの７日後の細胞数を示す；コンドロイチン硫酸（ＣＳ）、ヘパリン（ＨＳ）およびヒアルロン酸（ＨＡ）の種々のコーティングを含む；それらの最初の原液濃度から１：１０〜１：８０希釈；ＫＯ培地および馴化培地（ＣＭ）のコーティングを用いて成長した対照と比較；継代Ｐ０。
図１４９、表９は、継代Ｐ１において、ｈＥＳＣの細胞数がＣＳ、ＨＳおよびＨＡコートしたセルロースマイクロキャリアについて１００万／ウェルより多く、ＫＯ培地のコーティングを含む対照と類似することを示す。
図１５０、表１０は、ＤＥ−５３セルロースマイクロキャリアについて、継代０および１における細胞数を示す；フィブロネクチン（ＦＮ）；ヒアルロン酸（ＨＡ）＋ヘパリンナトリウム塩（ＨＳ）＋ＦＮ；ＨＡ＋ＨＳ；ＨＳ＋ＦＮ；およびＨＡ中にコートしたもの。
図１５１、表１１は、ＤＥ−５３セルロースマイクロキャリアについて、継代１、２および３における細胞数を示す；ＨＡ＋ＣｏｌＩ＋ＦＮ；ＨＡ＋ＣｏｌＩＶ＋ＦＮ；ＨＡ＋ＣｏｌＩ＋ＦＮ＋ＬＭ；ＨＡ＋ＣｏｌＩＶ＋ＦＮ＋ＬＭ；ＨＳ＋ＣｏｌＩ＋ＦＮ；ＨＳ＋ＣｏｌＩＶ＋ＦＮ；ＨＳ＋ＣｏｌＩ＋ＦＮ＋ＬＭ；ＨＳ＋ＣｏｌＩＶ＋ＦＮ＋ＬＭ中にコートしたもの。
図１５２は、（左から右へ）１００ミクロンのフィルター、機械的ピペッティング、ＴｒｙｐＬＥ酵素消化を用いた継代後の、および２Ｄコロニー対照の、Ｏｃｔ４、ＳＳＥＡ４およびＴＲＡ−１−６０の発現を示すチャートである。
図１５３は、マイクロキャリア上でのｈＥＳＣの連続継代を示す。９週間にわたる静止マイクロキャリア培養におけるｈＥＳＣの細胞密度を示すグラフ、および継代９におけるＯｃｔ４、ＳＳＥＡ４およびＴＲＡ−１−６０の発現を示すチャート。
図１５４は、マイクロキャリアおよび２Ｄコロニー培養におけるｈＥＳＣの細胞濃度を示すグラフである。
図１５５は、マイクロキャリアおよび２Ｄコロニー培養について、グルコースおよびグルタミンの比消費率、ならびにラクテートおよびアンモニアの比産生率を示すチャートである。
図１５６は、２種類の規定培地（ｍＴｅＳＲ１およびＳｔｅｍＰＲＯ）中でのマイクロキャリア培養に際してのｈＥＳＣの総数を示すチャートである。
図１５７は、規定培地（ｍＴｅＳＲ１およびＳｔｅｍＰＲＯ）中でマイクロキャリア上において培養したｈＥＳＣからのＯｃｔ４、ＳＳＥＡ４およびＴＲＡ−１−６０の発現を示すチャートである。
図１５８は、東ソー・マイクロキャリア上で培養した場合の、ｈＥＳＣの成長および継代、ならびにｈＥＳＣからのＯｃｔ４、ＳＳＥＡ４およびＴＲＡ−１−６０の発現を示す、顕微鏡写真およびチャートである。
図１５９は、２Ｄコロニー培養、静止マイクロキャリア培養および撹拌マイクロキャリア培養におけるｈＥＳＣの細胞濃度を示すチャートである。
図１６０は、（左から右へ）２Ｄコロニー培養、静止マイクロキャリア培養および撹拌マイクロキャリア培養におけるＯｃｔ４、ＳＳＥＡ４およびＴＲＡ−１−６０の発現率パーセントを示すチャートである。
図１６１は、撹拌マイクロキャリア培養（スピナーフラスコ）、静止マイクロキャリア培養および２Ｄ単層培養において培養したｈＥＳＣについて細胞総数を示すチャートである。
図１６２は、セルロースマイクロキャリア上でのヒトｉＰＳ細胞の培養を示す顕微鏡写真である。
図１６３は、マイクロキャリア培養におけるヒトｉＰＳ細胞からのＯｃｔ４、ＳＳＥＡ４およびＴＲＡ−１−６０の発現、ならびに３継代にわたるマイクロキャリア培養におけるヒトｉＰＳ細胞の成長を示す、チャートである。
図１６４は、ＭａｔｒｉｇｅｌコートしたＤＥ５３マイクロキャリア上での１０継代にわたるヒトｉＰＳ細胞の成長の成功、継代１０におけるマイクロキャリア培養ｉＰＳ細胞からのＯｃｔ４、ＳＳＥＡ４およびＴＲＡ−１−６０の発現を示すチャート、ならびにＭａｔｒｉｇｅｌコートしたＤＥ５３マイクロキャリア上での１０継代後のｉＰＳ細胞の顕微鏡写真である。
図１６５は、分化実験に用いたマイクロキャリアおよび種々のコーティングを示す表である。
図１６６は、ラミニン、フィブロネクチンおよびビトロネクチンでコートしたＤＥ５３マイクロキャリア上の細胞付着を、ｍａｔｒｉｇｅｌコートしたおよびコートしていないＤＥ５３マイクロキャリアならびに一般的なＥＢ培養と比較して示す顕微鏡写真である。
図１６７は、ラミニン、フィブロネクチンおよびビトロネクチン中にコートしたＤＥ５３マイクロキャリア、ならびにプロタミンおよびプロタミン＋ラミニンでコートした東ソー ６５マイクロキャリアを用いた、心筋細胞分化実験における拍動面積のパーセントおよび総面積を示すチャートである。
図１６８は、ラミニンマイクロキャリア、ｍａｔｒｉｇｅｌマイクロキャリア、およびコートしていないマイクロキャリア上での心筋細胞分化実験における拍動性集合体の形成を示す顕微鏡写真である。
図１６９は、ラミニンマイクロキャリア、ｍａｔｒｉｇｅｌマイクロキャリア、およびコートしていないマイクロキャリア上での心筋細胞分化実験に際しての細胞の拡張を示すチャートである。
図１７０は、マイクロキャリア上での分化のための無血清培地ｂＳＦＳに添加した添加剤を示す表である。
図１７１は、コートしていないマイクロキャリア上で、ｂＳＦＳ培地中における添加剤の使用により心筋細胞の形成が増強したことを示すチャートである。
図１７２は、マイクロキャリアからマイクロキャリアへ接種したｈＥＳＣを用いるマイクロキャリア上での分化のための無血清培地ｂＳＦＳまたはＤＭＥＭ／Ｆ１２＋ＳＢ２０３５８０に添加した添加剤を示す表である。
図１７３は、図１７２に記載した添加剤の存在下でマイクロキャリアからマイクロキャリアへ接種したｈＥＳＣからの心筋細胞形成が増強したことを示すチャートである。
図１７４は、Ｃｙｔｏｄｅｘ ３マイクロキャリア上で、図１７５に記載するマイクロキャリア濃度における、ｈＥＳＣ由来ＭＳＣの成長を示すチャートである。
図１７５は、実施例４２．１に用いたマイクロキャリアおよび細胞の濃度ならびに達成された倍増時間を示す表である。
図１７６は、Ｃｙｔｏｄｅｘ ３マイクロキャリア上で、図１７７に記載する細胞接種濃度における、ｈＥＳＣ由来ＭＳＣの成長を示すチャートである。
図１７７は、実施例４２．２に用いたマイクロキャリアおよび細胞の濃度ならびに達成された倍増時間を示す表である。
図１７８は、Ｃｙｔｏｄｅｘ ３マイクロキャリア上および単層対照培養におけるｈＥＳＣ由来ＭＳＣの成長の比較を示すチャートである。
図１７９は、実施例４２．３に用いたマイクロキャリアおよび細胞の濃度ならびに達成された細胞密度および倍増時間を示す表である。
図１８０は、Ｃｙｔｏｄｅｘ ３マイクロキャリア上で３継代にわたるｈＥＳＣ由来ＭＳＣの成長を、２種類の継代方法について示すチャートである（実施例４２．４を参照）。
図１８１は、Ｃｙｔｏｄｅｘ ３マイクロキャリア上で３継代にわたって成長させたｈＥＳＣ由来ＭＳＣについて達成された倍増時間を、２種類の継代方法について示すチャートである（実施例４２．４を参照）。
図１８２は、Ｃｙｔｏｄｅｘ ３マイクロキャリア上で３継代にわたって成長させたｈＥＳＣ由来ＭＳＣについて、ＭＳＣマーカーＣＤ３４、ＣＤ２９、ＣＤ７３、ＣＤ４５、ＣＤ４４、ＣＤ９０およびＣＤ１０５に関する１０日目のＦＡＣＳ分析を示す；マイクロキャリアの添加により継代した場合。
図１８３は、Ｃｙｔｏｄｅｘ ３マイクロキャリア上で３継代にわたって成長させたｈＥＳＣ由来ＭＳＣについて、ＭＳＣマーカーＣＤ３４、ＣＤ２９、ＣＤ７３、ＣＤ４５、ＣＤ４４、ＣＤ９０、ＣＤ１０５に関する１０日目のＦＡＣＳ分析を示す；ｔｒｙｐＬＥ酵素を用いる脱着に続いてマイクロキャリアの添加により継代した場合。
図１８４は、ラミニンコーティング（１〜３マイクログラム／グラム（セルロースマイクロキャリア））が、フィブロネクチンコートしたマイクロキャリアまたはコートしていないマイクロキャリアと比較して、より良好な細胞付着、したがって増大した数の拍動性集合体をもたらすことを示す。
図１８５は、ラミニンコートしたＤＥ５３マイクロキャリア培養における種々の培地補充物の評価を示し、化学的に規定された脂質混合物、ビタミン溶液、およびＨｙＳｏｙ（ダイズ水解物）が有意に増大した数の拍動性胚様体または心筋細胞を生じることが示される。
図１８６は、２種類のヒトｉＰＳ細胞を無血清培地ｍＴｅＳＲ１中でセルロースマイクロキャリア上において２または３週間にわたって連続継代すると、細胞数の増加、ならびに多分化能性マーカーＯｃｔ−４およびｍＡｂ８４の安定発現が示されることを示す。
図１８７は、管理された低グルコース供給実験で得られたｈＥＳＣの細胞密度を示すグラフである。] 図１００ 図１０１ 図１０２ 図１０３ 図１０４ 図１０５ 図１０６ 図１０７ 図１０８ 図１０９
[0117] 本発明の１以上の態様を、たとえば本発明者らが考える本発明の実施に最良の様式の具体的な詳細を含めて、以下に記載する記述中に述べる。これらの具体的な詳細に限定されることなく本発明を実施しうることは当業者に明らかであろう。]
[0118] 懸濁培養におけるｈＥＳＣの長期安定伝播
本発明者らは、懸濁培養におけるヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）の長期安定伝播を今回証明した。特に、マイクロキャリアのＭａｔｒｉｇｅｌ、ヒアルロン酸およびラミニンコーティングは、ｈＥＳＣが多分化能性を維持した状態で少なくとも継代５を超えて、一般に継代８、９または１０を超えて伝播されるのを可能にすることを本発明者らは証明する。こうして本発明者らは、２５連続継代を超えるマイクロキャリア懸濁培養を証明するのに今回成功し、培養された細胞を細胞密度の分析、生存率、多分化能性マーカーのＦＡＣＳ分析、組織学的分析、および核型により特性分析した。]
[0119] 本発明者らは、最高２３継代後の成長速度、多分化能性マーカーＯｃｔ４、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ−１−６０およびＭａｂ８４の発現、正常な核型、ならびに３胚葉に分化する能力の維持により測定して、ヒト胚性幹細胞の長期伝播のためのマイクロキャリア培養の安定性を証明した。]
[0120] マイクロキャリア上のｈＥＳＣを無血清培地中での成長にも適応させ、それらのアミノ
酸代謝率を測定した。さらに、マイクロキャリア培養をｈＥＳＣ系についてスピナーフラスコにまでスケールアップした。セルロースマイクロキャリア上のｈＥＳＣと球形Ｃｙｔｏｄｅｘ ３、東ソーおよびセルロースマイクロキャリア上で増殖したフィーダー細胞との共培養も証明した。]
[0121] 本発明者らは、５タイプのマイクロキャリア：ＤＥ５３セルロース、東ソー（１０および６５ミクロン）、Ｃｙｔｏｄｅｘ ３およびＨｉｌｌｅｘ（すべてｍａｔｒｉｇｅｌでコートしたもの）がｈＥＳＣを長期培養において支持しうることを証明した。しかし、これらのマイクロキャリアは、マトリックスコーティングがなければ、多分化能性マーカーのダウンレギュレーションおよび細胞密度の低下なしに５継代または最良で１０継代を超えてｈＥＳＣを支持することはできない。]
[0122] 胚性幹細胞の培養に必要なマイクロキャリアの特性を模式的にまとめたものを図１４０に示す。マイクロキャリアは、長さ２０〜２０００ミクロン、直径５〜５０ミクロンのロッドまたは円筒もしくはらせん様であってもよい。それらは５０〜２０００ミクロンの範囲の直径をもつ球形または卵様であってもよい。本発明のマイクロキャリアの組成は、セルロース、デキストラン、ヒドロキシル化メタクリレート、ポリスチレン、ガラス、コラーゲン、ゼラチン、マクロ多孔質またはミクロ多孔質ｃａｒｂｏｓｅｅｄまたは他の材料であってもよい。マイクロキャリアは、好ましくは陽電荷をもつか、またはコラーゲン／ゼラチン材料のものである。マイクロキャリアは、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）、たとえばｍａｔｒｉｇｅｌ、ヒアルロン酸、ヘパリン、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、または他のＥＣＭでコートされてもよい。これらのＥＣＭは、それらに吸着された成長因子を含まなくてもよく、含んでもよい。] 図１４０
[0123] 特に、本発明者らは下記を証明するのに今回成功した：
１．ＤＥ５３セルロースマイクロキャリア上におけるｈＥＳＣの継代２３までの連続継代；
２．セルロースマイクロキャリア上で培養したｈＥＳＣの特性分析（胚様体の核型判定、ＲＴ−ＰＣＲ、およびテラトーマ形成）；
３．アミノ酸代謝データ分析による、無血清培地でのｈＥＳＣ−セルロースマイクロキャリアの培養；
４．スピナーフラスコ内における２種類のｈＥＳＣ細胞系のセルロースマイクロキャリア培養；
５．球形またはロッド形マイクロキャリア上のフィーダー細胞とロッド形セルロースマイクロキャリア上で成長したｈＥＳＣとの共培養；
６．Ｍａｔｒｉｇｅｌを含む小型および大型球形マイクロキャリア上におけるｈＥＳＣ培養；
７．Ｍａｔｒｉｇｅｌを含む大型マイクロキャリア上におけるｈＥＳＣ培養；
８．ｈＥＳＣ培養のためのセルロースマイクロキャリア上のヒアルロン酸コーティング。]
[0124] 幹細胞の懸濁培養および継代
本発明者らは、霊長類およびヒトの幹細胞ならびにｉＰＳ細胞を粒子上で培養、伝播および継代するのが可能であることを今回証明した。特に、本発明者らは幹細胞を懸濁培養において連続成長させ、かつ継代しうることを示す。本発明者らは、マイクロキャリア上でのヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）の連続的で継代可能な三次元培養を証明する。]
[0125] 本発明者らは、幹細胞を懸濁状態で伝播させる方法を記載する。この伝播方法は、幹細胞を成長（増殖）（ｇｒｏｗｉｎｇ）、伝播（ｐｒｏｐａｇａｔｉｎｇ）、増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ）、培養（ｃｕｌｔｕｒｉｎｇ）、拡張（ｅｘｐａｎｄｉｎｇ）ま
たは増加（ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ）させることを含むことができる。伝播させる幹細胞を、後記に述べるように１継代以上、継代することができる。そのような伝播は、特定の特性を備えたマイクロキャリアまたは粒子の使用により達成できる。これらのマイクロキャリアまたは粒子は、電荷をもつことができる。マイクロキャリアまたは粒子は、コーティングを含むことができる。他の特性には、サイズを含めることができる。]
[0126] 幹細胞を伝播させる方法は、粒子を供給する工程を含むことができる。粒子は、それにコートされたマトリックスを含むことができ、かつ陽電荷をもつことができる。粒子は、それに付着した霊長類またはヒトの幹細胞の集合が可能なサイズをもつことができる。幹細胞を粒子に付着させる。異なる粒子上で成長している細胞を互いに接触させて、集合体を形成させる。この培養物を少なくとも１継代、継代する。幹細胞をキャリアに付着た状態で、またはそれらから脱着もしくは分離して使用することができる。それらは未分化もしくは多分化能性の状態または両方で使用でき、あるいは目的とする細胞タイプに分化させることができる。それらを用いて胚様体を形成することができる。]
[0127] 粒子が連続成長を支持するためには、それらは霊長類またはヒトの幹細胞の寸法と適合するサイズをもたなければならない：たとえば１０μｍ、２０μｍ、３０μｍ、４０μｍ、５０μｍ、６０μｍ、７０μｍ、８０μｍ、９０μｍ、１００μｍ、１１０μｍ、１２０μｍ、１３０μｍ、１４０μｍ、１５０μｍ、１６０μｍ、１７０μｍ、１８０μｍ、１９０μｍ、２００μｍ、２１０μｍ、２２０μｍ、２３０μｍ、２４０μｍ、２５０μｍなど。この大きさのサイズをもつそのような粒子上での霊長類またはヒトの幹細胞の培養により、それらの上で成長している細胞が互いに集合し、連続成長を支持することが可能になるであろう。粒子の適切な組成、形状およびサイズを、後記にさらに詳細に記載する。]
[0128] 実施例は、幹細胞培養物、たとえばヒト胚性幹細胞の２Ｄコロニー培養物をマイクロキャリア粒子上に接種し、１以上の継代を伴う数世代、連続成長させうることを示す。幹細胞をいずれかの手段、たとえば機械的解離もしくは酵素解離または両方法の組合わせで表面から離脱させることにより、継代することができる。]
[0129] マイクロキャリア粒子培養物を、粒子上で世代から世代へ成長させることができる。あるいは、またはさらに、その間に１以上の世代について培養物を一般的な２Ｄ培養において成長させることができる。マイクロキャリア上で成長しているヒト幹細胞を２Ｄコロニー培養に戻すことができ、その逆も可能である。]
[0130] 本明細書に記載する方法により、幹細胞を最初は未分化の形態で効率的に伝播させる方法が得られる。それらは、機械的解離または酵素解離により分割比率１：２〜１：１０でマイクロキャリア培養物をマイクロキャリア上へ継代することを可能にする；この比率は一般的な２Ｄ培養について可能なものより高い。これによって、培養をより速やかにスケールアップして生物材料をより効率的に利用することができる。]
[0131] マイクロキャリア培養における細胞の体積収率は、２Ｄコロニー対照より普通は２〜４倍高い。本明細書に記載する方法により伝播させたヒト幹細胞の体積収率は、２００万細胞／ｍｌまたはそれ以上に及ぶ可能性がある。]
[0132] 本明細書に記載する方法により、後記にさらに詳細に記載するように、ヒト幹細胞を粒子から粒子へ１０継代以上継代することが可能になる。
本明細書に記載する方法により、それらの多分化能性を保持した幹細胞を伝播させることが可能になる。実施例は、本明細書に記載する方法および組成物により伝播したヒト胚性幹細胞が幹細胞の１以上の生物学的特性を維持することを示す。たとえば、伝播した幹
細胞は５継代について、２Ｄコロニー培養で成長した幹細胞と同等な多分化能性マーカー、Ｏｃｔ−４、Ｔｒａ−１−６０およびＳＳＥＡ−４の発現を示し、正常な核型を保持し、かつインビトロ（胚様体）およびインビボ（テラトーマ）で分化して３胚葉になることができる。]
[0133] 重要なことに、幹細胞をセルロースマイクロキャリア上に固定すると、より大規模なスピナーフラスコ内で連続継代することができる。
いかなる幹細胞も本明細書に記載する方法を用いて伝播させることができる。これらには、霊長類の幹細胞、たとえばサル、類人猿またはヒトの幹細胞を含めることができる。幹細胞には、胚性幹細胞または成体幹細胞を含めることができる。幹細胞には、誘導した多分化能性幹細胞を含めることができる。たとえば、幹細胞には、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）を含めることができる。本明細書に記載する方法および組成物に使用するのに適切なこれらおよび他の幹細胞については後記にさらに詳細に記載する。]
[0134] 本明細書に記載する方法および組成物は、既知の”２Ｄ”培養法に優る種々の利点をもつ。本発明の粒子は幹細胞の付着において、２Ｄコロニー培養支持体より効率的である。この理由その他のため、懸濁培養した細胞はより効率的に継代することができる。本明細書に記載する方法により、幹細胞を数サイクルにわたって凍結および融解することが可能になる。それらをマイクロキャリア上で直接凍結し、増殖培地（伝統的な平板培養であっても、または粒子状マイクロキャリア上であっても）上へ融解することができる。マイクロキャリア上で伝播させた幹細胞を、ＧＭＰ適応した無血清培地中で成長させることができる。]
[0135] 本明細書に記載する方法により、幹細胞、たとえば胚性幹細胞を、未分化状態で培養および維持することが本質的に可能になる。伝播した幹細胞を培養状態で（たとえばマイクロキャリア上で）またはそれから脱着させて、部分的または全体的に分化させることができる。]
[0136] 伝播した幹細胞を用いて、その後使用するために胚様体を形成することができる。マイクロキャリア上で成長している幹細胞を分化用培地へ移植するだけで、胚様体を直接形成することができる；これは、胚様体形成の前に細胞を２Ｄ成長表面から分離する追加工程を必要とする先行技術方法と対照的である。したがって、本明細書に記載する方法により、幹細胞を、成長している表面または支持体上で、それから分離することなく定方向分化させることが可能になる。]
[0137] 本明細書に記載する方法および組成物によって、培養した幹細胞をより大きな体積に拡張およびスケールアップするのが可能になる。バイオリアクターまたは工業的規模へのスケールアップは、より生産性の高い幹細胞培養を可能にする。マイクロキャリア上で撹拌培養により幹細胞を成長させるのが可能であることは、培養を懸濁条件にまでスケールアップできることを意味する。制御されたバイオリアクター、たとえばＷａｖｅ Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒまたは撹拌培養を採用できる。これによって、現在の足場依存型の二次元コロニー培養の制約と比較して、細胞をより大きな体積で拡張させることが可能になる。数百リットルに及ぶバイオリアクター内での大規模懸濁培養が可能である。]
[0138] 陽電荷
本発明の粒子またはマイクロキャリアは、たとえば中性ｐＨまたは生理学的関連ｐＨ、たとえばｐＨ７．４またはｐＨ７．２で陽電荷をもつことができる。粒子はクロマトグラフィー樹脂、たとえばアニオン交換樹脂を含むことができる。]
[0139] 陽電荷の量は重要ではあるが、きわめて重要というわけではなく、細胞が粒子に付着し
うるのに十分な高さである限り、広範に及ぶことができる。たとえば、粒子がアミン、たとえば第四級または第三級アミンとのカップリングにより荷電した場合、粒子上の電荷は乾燥材料（粒子の）のグラム当たり約０．５〜４ミリ当量、たとえば乾燥材料（粒子の）のグラム当たり約１〜３．５ミリ当量、または乾燥材料（粒子の）のグラム当たり約１〜２ミリ当量の小さなイオン交換容量に相当する可能性がある。]
[0140] 陽電荷は、粒子のｐＫａが７より大きい（たとえば７．４より大きい、たとえば７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１０．５、１１、１１．５またはそれ以上）ものであってもよい。]
[0141] たとえば、最高２０ｍｇ／粒子ｍＬの濃度の硫酸プロタミンまたはポリ−Ｌ−リジン塩酸塩にカップリングさせることにより粒子を誘導体化することができる。
理論により拘束されたくはないが、粒子上の陽電荷の存在により細胞がそれに付着するのが可能になると本発明者らは考える。]
[0142] 本発明の粒子は、当技術分野で既知のいずれかの手段で陽電荷をもつことができる。粒子は陽電荷をもつ基を含むことができ、あるいは粒子がこれらをもつように誘導体化することができる。]
[0143] 本発明の粒子は、ジエチルアミノエチル−セルロース（ＤＥＡＥ−セルロース）またはその誘導体を含むことができる。ＤＥＡＥ−セルロースは、炭水化物のＣＨ２ＯＨ基をイオン化性第三級アミン基に変換するように化学修飾された微粒状セルロースを含む。それは中性ｐＨで陽電荷をもつ。粒子は、Ｓｅｐｈａｄｅｘビーズ、たとえばＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘを含むことができる。粒子は、共有架橋していてもよいアガロースビーズ、たとえばＳｅｐｈａｒｏｓｅ（すなわちＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）を含むことができる。粒子はＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｃｅｌを含むことができる。ＤＥＡＥ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅおよびＤＥＡＥ−ＳｅｐｈａｃｅｌおよびＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手できる。粒子はＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ ＦｌｏｗまたはＳ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗを含むことができる。Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅの荷電基は、力価測定できない陽電荷をもつ第四級アミンである。]
[0144] 本発明の粒子は、陽電荷をもつように誘導体化されていてもよい。たとえば、粒子はそれに結合したアミン基を含むことができる。アミン基は第一級アミン基、第二級アミン基、第三級アミン基または第四級アミン基であってよい。粒子とアミン含有化合物のカップリングにより、アミン基を粒子に結合させることができる。カップリング方法は当技術分野で周知である。たとえば、臭化シアンを用いてアミンを粒子にカップリングさせることができる。]
[0145] 架橋剤も使用できる。これらは、２つの同一反応基を含むホモ二官能性架橋剤、または２つの異なる反応基を含むヘテロ二官能性架橋剤に分類される。ヘテロ二官能性架橋剤は、重合を最小限に抑えた連続コンジュゲーションを可能にする。カップリングおよび架橋用の試薬は多数の製造業者から、たとえばＣａｌｂｉｏｃｈｅｍまたはＰｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙから得ることができる。]
[0146] 粒子の反応性を高めるために、粒子をカップリング前に活性化することができる。クロロ酢酸を用いてコンパクトな粒子を活性化し、続いてＥＤＡＣ／ＮＨＳ−ＯＨを用いてカップリングを行なうことができる。ヘキサンジイソシアネートを用いて粒子を活性化して、第一級アミノ基を付与することもできる。そのような活性化された粒子をいずれかのヘテロ二官能性架橋剤と組み合わせて用いることができる。ある態様においては、ジビニルスルホンを用いてコンパクトな粒子を活性化する。そのような活性化されたコンパクトな
粒子は、たとえばペプチド上のアミノ基またはチオール基と反応しうる部分を含む。]
[0147] トレシルクロリド（ｔｒｅｓｙｌ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）を用いて粒子を活性化して、アミノ基またはチオール基と反応しうる部分を付与することもできる。塩化シアンを用いて粒子を活性化して、アミノ基またはチオール基と反応しうる部分を付与することもできる。]
[0148] Ｃｙｔｏｄｅｘ １は、架橋デキストランマトリックスをベースとし、これが陽電荷をもつＮ，Ｎ−ジエチルアミノエチル基で置換されている。この荷電基はマイクロキャリアマトリックス全体に分布している。]
[0149] 荷電していない粒子
本発明の粒子またはマイクロキャリアは、荷電していなくてもよく、あるいはたとえば中性ｐＨまたは生理学的関連ｐＨ、たとえばｐＨ７．４またはｐＨ７．２で電荷中性であってもよい。]
[0150] 荷電していない粒子の例には、ゼラチンまたはコラーゲンの粒子が含まれる。たとえば、Ｃｙｔｏｄｅｘ ３は架橋デキストランのマトリックスに化学的にカップリングした変性コラーゲンの薄層からなる。]
[0151] マトリックスコーティング
本発明の粒子をマトリックスでコートすることができ、これを本明細書に関しては粒子に、たとえばその表面に、付着した物質の層（たとえば薄層またはフィルム）と言う。マトリックスは、細胞の成長を支持しうる生体適合性または生理学的関連性のマトリックスを含むことができる。それは細胞成長のための基質を含むことができる。]
[0152] 前記のマトリックスは、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の成分を含むことができる。ＥＣＭのいずれかの既知成分、たとえば幹細胞の成長を支持しうるものを使用できる。細胞外マトリックスの成分は当技術分野で既知であり、たとえばAlberts et al (2002), Molecular Biology of the Cell, Chapter IV、およびそれに引用された参考文献に記載されている。]
[0153] ＥＣＭ成分を常法により粒子に付着またはカップリングまたはコートすることができる。たとえば、前記のいずれかのカップリング試薬および架橋剤を用いてＥＣＭ成分を粒子にカップリングさせることができる。]
[0154] ＥＣＭ成分は、高分子、たとえば多糖類、タンパク質、プロテオグリカン、糖タンパク質、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）（通常はタンパク質にプロテオグリカンの形で共有結合した状態でみられる）、繊維状タンパク質：エラスチン、フィブロネクチンおよびラミニンを含む、コラーゲン（たとえばＩ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、ＶＩ型コラーゲン）などを含むことができる。]
[0155] マトリックスコーティングはグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）を含むことができる。グリコサミノグリカンは、反復二糖単位からなる枝分かれしていない多糖鎖を含む。反復二糖中の２つの糖のうちの１つは常にアミノ糖（Ｎ−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセチルガラクトサミン）であり、これは大部分の場合、硫酸化されている。第２の糖は通常はウロン酸（グルクロン酸またはイズロン酸）である。]
[0156] マトリックスコーティングは、ヒアルロナン（ヒアルロン酸またはヒアルロネートとも呼ばれる）またはその誘導体を含むことができる。ヒアルロン酸は、多数の供給源のいず
れかに由来するもの、たとえばウシのガラス体液に由来するものであってもよい。ヒアルロン酸の塩または塩基、たとえばヒアルロン酸ナトリウムを使用できる。これは連鎖球菌に由来するものであってもよい。]
[0157] マトリックスコーティングはラミニンを含むことができる。
マトリックスコーティングはフィブロネクチンを含むことができる。
マトリックスコーティングはビトロネクチンを含むことができる。]
[0158] マトリックスコーティングは、たとえばＧＡＧ、たとえばコンドロイチン硫酸、デキストラン硫酸、ヘパラン硫酸およびケラタン硫酸を、たとえばタンパク質にプロテオグリカンとして連結したものとして含むことができる。ＥＣＭ成分はアグレカン（ａｇｇｒｅｃａｎ）、デコリン（ｄｅｃｏｒｉｎ）などを含むことができる。]
[0159] マトリックスコーティングは、ヘパラン、またはそれの誘導体、たとえば塩基もしくは塩類を含むことができる。マトリックスコーティングはヘパラン硫酸プロテオグリカンを含むことができる。ヘパラン硫酸プロテオグリカンは、多数の供給源のいずれかに由来するもの、たとえばウシの腎臓に由来するものであってもよい。]
[0160] マトリックスコーティングは、デキストラン、たとえばデキストラン硫酸またはデキストラン硫酸ナトリウムを含むことができる。マトリックスコーティングは、フィブロネクチン、ラミニン、ニドゲン（ｎｉｄｏｇｅｎ）、またはＩＶ型コラーゲンを含むことができる。マトリックスコーティングはコンドロイチン硫酸を含むことができる。]
[0161] マトリックスコーティングは、ゼラチン、ポリオルニチンを含むか、またはフィブロネクチンのＲＧＤ結合ドメインの結合モチーフを含むことができる。
マトリックスコーティングは、これらの成分のうちいずれか２種類以上の種々の割合の混合物を含むことができる。マトリックスコーティングは、精製した、または実質的に精製したＥＣＭ成分を含むことができる。マトリックスコーティングは、部分精製したＥＣＭ成分を含むことができる。それはＥＣＭ抽出物、たとえばＭａｔｒｉｇｅｌを含むことができる。]
[0162] 細胞培養は、種々のマトリックスコーティングをもつ粒子を含むことができる。たとえば、前記のものから選択される第１マトリックスコーティングをもつ第１粒子集団、および前記のものから選択される第２マトリックスコーティングをもつ第２粒子集団。]
[0163] Ｍａｔｒｉｇｅｌ
本発明の粒子は、Ｍａｔｒｉｇｅｌを含むマトリックスコーティングでコートすることができる。]
[0164] Ｍａｔｒｉｇｅｌは、マウス腫瘍細胞から分泌されるゲル状タンパク質混合物の商品名であり、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（米国マサチュセッツ州ベッドフォード）から市販されている。この混合物は、多くの組織にみられる複雑な細胞外環境に類似し、細胞生物学者が細胞培養のための基質として用いている。]
[0165] ＢＤ Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）マトリックスは、ＥＨＳマウス肉腫、すなわちＥＣＭタンパク質に富む腫瘍から抽出された可溶化した基底膜調製物である。それの主成分は、ラミニン（約５６％）、続いてＩＶ型コラーゲン（約３１％）、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、およびエンタクチン１（約８％）である。室温でＢＤ Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）マトリックスは重合して、哺乳動物の細胞基底膜に類似する生物活性マトリックス材料を生成する。]
[0166] 一般的な実験室手法は、少量の冷却（４℃）Ｍａｔｒｉｇｅｌをプラスチック製の組織培養実験器具などの表面に分配するものである。３７℃（体温）でインキュベートすると、Ｍａｔｒｉｇｅｌタンパク質は自己集合して薄膜を生成し、これが表面を覆う。]
[0167] Ｍａｔｒｉｇｅｌは、細胞の形態、生化学的機能、移動または侵入、および遺伝子発現に関して生理学的に適切な環境を提供する。
Ｍａｔｒｉｇｅｌが複雑な細胞挙動を刺激する能力は、それの不均質な組成の結果である。Ｍａｔｒｉｇｅｌの主成分は構造タンパク質、たとえばラミニンおよびコラーゲンであり、これらが培養細胞にそれらの自然環境で遭遇するであろう接着ペプチド配列を提供する。多くの細胞タイプの分化および増殖を促進する成長因子も存在する。Ｍａｔｒｉｇｅｌは下記の成長因子を含む（濃度範囲、平均濃度）：ＥＧＦ（０．５〜１．３ｎｇ／ｍｌ，０．７ｎｇ／ｍｌ），ｂＦＧＦ（＜０．１〜０．２ｐｇ／ｍｌ，未知），ＮＧＦ（＜０．２ｎｇ／ｍｌ，未知），ＰＤＧＦ（５〜４８ｐｇ／ｍｌ，１２ｐｇ／ｍｌ），ＩＧＦ−１（１１〜２４ｎｇ／ｍｌ，１６ｎｇ／ｍｌ），ＴＧＦ−β（１．７〜４．７ｎｇ／ｍｌ，２．３ｎｇ／ｍｌ）。Ｍａｔｒｉｇｅｌは多数の他のタンパク質を少量含有する。]
[0168] マトリックスコーティングの変更
ある態様においては、第１マトリックスコーティングをもつ粒子上で１継代以上（たとえば１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０継代またはそれ以上）細胞を培養した後、異なる（第２）マトリックスコーティングをもつ粒子へ１継代以上（たとえば１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０継代またはそれ以上）移植することができる。場合により、次いで第２コーティングと異なるマトリックスコーティングをもつ粒子へ、たとえば元の第１マトリックスコーティングもしくは他のマトリックスコーティングをもつ粒子またはコートしていない粒子へ細胞を移植することができる。]
[0169] 粒子組成
本明細書に記載する方法および組成物においては、粒子またはマイクロキャリア上で幹細胞を伝播させる。本明細書中で用いる用語として、”粒子”にはその上で幹細胞が付着または成長しうるいずれかの支持体が含まれる。粒子は後記に述べるようにいかなる形状または構造であってもよい。]
[0170] 粒子には、IUPAC Compendium of Chemical Terminology (2nd Edition, 1992, Vol. 64, p. 160)に記載されるマイクロキャリアを含めることができる。
粒子は、それが前記のようにたとえば幹細胞に対する付着点または支持体としてのその目的を果たすのを可能にする物理的特性をもつ限り、いかなる材料も含むことができる。したがって、粒子はこの目的のために、硬い（ｓｔｉｆｆ）、剛性（ｒｉｇｉｄ）、展性（ｍａｌｌｅａｂｌｅ）、中実（ｓｏｌｉｄ）、多孔質（ｐｏｒｏｕｓ）その他の材料を含むことができる。それは固体材料または半固体、ゲルなどの材料を含むことができる。]
[0171] その材料は、少なくとも陽電荷および／またはマトリックスコーティングの付着を可能にするために反応性であり、あるいは活性剤によって反応性にすることができるが、その他の点では一般に不活性である物質を含むことができる。粒子は複合材料を含むことができ、したがって１種類より多い材料で粒子を構成することができる。たとえば、粒子のコアが表面部分と異なる材料を含むことができる。たとえば、粒子のコアは一般に不活性である材料を含むことができ、一方、表面部分はマトリックスまたは陽電荷の付着または化学的カップリングのために反応性である材料を含むことができる。]
[0172] 粒子は天然由来のものまたは合成によるものであってよい。天然材料および合成材料ならびにそれらを得るための供給源は、当技術分野で周知である。粒子は、少なくともある
程度の機械的抵抗性、化学的攻撃もしくは熱処理に対する少なくともある程度の抵抗性、またはこれらの組合わせをもつことができる。]
[0173] 別態様において、粒子は”非生物性”物体を含むことができる；この用語は、細胞性材料を含まないか、または実質的に含まないことを意味する。したがって、そのような非生物性または非細胞性の粒子は、合成材料、または天然には存在しない材料を含むことができる。種々の形状をもつ種々の粒子が当技術分野で知られており、これにはたとえば多様な種類のビーズが含まれる。粒子の態様には、マイクロビーズ、たとえばアガロースビーズ、ポリアクリルアミドビーズ、シリカゲルビーズなどが含まれる。]
[0174] たとえば、粒子を作製する材料は、プラスチック、ガラス、セラミック、シリコーン、ゼラチン、デキストラン、セルロース、ヒドロキシル化メタクリレート、ポリスチレン、コラーゲンその他を含むことができる。たとえば、セルロースまたは誘導体、たとえばＤＥＡＥ−セルロースで粒子を作製することができる（後記に述べる）。粒子は、セルロース、改質した親水性ビーズ、およびカーボンをベースとするマイクロキャリアを含むことができる。]
[0175] 粒子は市販のマトリックスまたはキャリア、たとえばビーズまたはマイクロビーズを含むことができる。粒子は、クロマトグラフィー用マトリックスとして使用するために販売されている樹脂、たとえばアニオン交換樹脂を含むことができる。]
[0176] 粒子は、セルロースマイクロキャリアを含むことができる。粒子は、ＤＥ−５２（Ｗｈａｔｍａｎ）、ＤＥ−５３（Ｗｈａｔｍａｎ）またはＱＡ−５２（Ｗｈａｔｍａｎ）を含むことができる。粒子は、親水性マイクロキャリア、ヒドロキシル化メタクリレートマトリックスマイクロキャリア、または誘導体化した親水性ビーズ状マイクロキャリアを含むことができる。粒子は、ＴＳＫｇｅｌ Ｔｒｅｓｙｌ−５Ｐｗ（東ソー）またはＴｏｙｏｐｅａｒｌＡＦ−Ｔｒｅｓｙｌ−６５０（東ソー）を含むことができる。粒子は、マクロ多孔質またはミクロ多孔質ｃａｒｂｏｓｅｅｄマイクロキャリア、たとえばＳＭ１０１０（Ｂｌｕｅ Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ）またはＳＨ１０１０（Ｂｌｕｅ Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ）を含むことができる。]
[0177] 粒子はデキストランをベースとするマイクロキャリアであってもよい。粒子は、Ｃｙｔｏｄｅｘ １（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）またはＣｙｔｏｄｅｘ ３（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を含むことができる。Ｃｙｔｏｄｅｘ １は架橋デキストランマトリックスをベースとし、陽電荷をもつＮ，Ｎ−ジエチルアミノエチル基でこれが置換されている。荷電基はマイクロキャリアマトリックス全体に分布している。Ｃｙｔｏｄｅｘ ３は、架橋デキストランのマトリックスに化学的にカップリングした変性コラーゲンの薄層からなる。]
[0178] 粒子は、ポリスチレンをベースとするマイクロキャリアであってもよい。粒子は、ＨｉｌｌｅｘまたはＨｉｌｌｅｘ ＩＩ（ＳｏｌｏＨｉｌｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｉｎｃ．）を含むことができる。ＨｉｌｌｅｘおよびＨｉｌｌｅｘ ＩＩは、カチオン性トリメチルアンモニウムコーティングをもつ改質ポリスチレンマイクロキャリアである。]
[0179] 粒子は、細胞をその上で成長させる前に処理することができる。そのような処理は、本明細書の他の箇所に記載するように、より大きい接着性、電荷の利用能、生体適合性などの達成を目標とするものであってもよい。]
[0180] セルロースマイクロキャリア、たとえばＤＥ−５３、ＤＥ−５２およびＱＡ−５２は、ロッド形であってもよい。
細胞培養物は、１より多いタイプの粒子の混合物を含むことができる。たとえば、第１粒子集団（たとえばコンパクトな形状の粒子の）および第２粒子集団（たとえば細長い形状の粒子の）。ある態様においては、第１細胞タイプ、たとえばフィーダー細胞を第１粒子に付着させ、第２細胞タイプ、たとえばｈＥＳＣを第２粒子に付着させることができる。各タイプの粒子は、同一または異なるマトリックスコーティングをもつことができる。場合により、一方または両方のタイプの粒子がマトリックスコーティングをもたなくてもよい。]
[0181] ビーズ
使用するのに適切なビーズまたはマイクロビーズには、ゲルクロマトグラフィーに用いられるもの、たとえばゲル濾過媒体、たとえばＳｅｐｈａｄｅｘが含まれる。この種の適切なマイクロビーズには、下記のものが含まれる：Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−１０：ビーズサイズ４０〜１２０をもつもの（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号２７，１０３−９）、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−１５：ビーズサイズ４０〜１２０μｍをもつもの（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ カタログ番号２７，１０４−７）、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５：ビーズサイズ２０〜５０μｍをもつもの（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ カタログ番号２７，１０６−３）、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５：ビーズサイズ２０〜８０μｍをもつもの（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ カタログ番号２７，１０７−１）、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５：ビーズサイズ５０〜１５０μｍをもつもの（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ カタログ番号２７，１０９−８）、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５：ビーズサイズ１００〜３００μｍをもつもの（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ カタログ番号２７，１１０−１）、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−５０：ビーズサイズ２０〜５０μｍをもつもの（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ カタログ番号２７，１１２−８）、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−５０：ビーズサイズ２０〜８０μｍをもつもの（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ カタログ番号２７，１１３−６）、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−５０：ビーズサイズ５０〜１５０μｍをもつもの（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ カタログ番号２７，１１４−４）、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−５０：ビーズサイズ１００〜３００μｍをもつもの（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ カタログ番号２７，１１５−２）、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−７５：ビーズサイズ２０〜５０μｍをもつもの（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ カタログ番号２７，１１６−０）、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−７５：ビーズサイズ４０〜１２０μｍをもつもの（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ カタログ番号２７，１１７−９）、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−１００：ビーズサイズ２０〜５０μｍをもつもの（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ カタログ番号２７，１１８−７）、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−１００：ビーズサイズ４０〜１２０μｍをもつもの（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ カタログ番号２７，１１９−５）、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−１５０：ビーズサイズ４０〜１２０μｍをもつもの（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ カタログ番号２７，１２１−７）、およびＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２００：ビーズサイズ４０〜１２０μｍをもつもの（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ カタログ番号２７，１２３−３）；ただし、本明細書の他の箇所に記載するように、それらがサイズに関して適合する限りにおいてである。]
[0182] Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビーズ、たとえば液体クロマトグラフィーに用いられるものも使用できる。例はＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、Ｓ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅおよびＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビーズであり、たとえばＡｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｅｕｒｏｐｅ ＧｍｂＨ（Ｆｒｅｉｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＸＬ（カタログ番号１７−５０７２−０１）、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＸＬ（カタログ番号１７−５０７２−０４）、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＸＬ（カタログ番号１７−５０７２−６０）、ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＸＬ（カタログ番号１７−５０７３−０１）、ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＸＬ（カタログ番号１７−５０７３−０４）およびＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＸＬ（カタログ番号ｌ １７−５０７３−６０）などとして入手できる。]
[0183] 粒子の形状
粒子は細胞の成長に適切ないずれかの形状、たとえばコンパクトな形状または細長い形状をもつことができる。]
[0184] コンパクトな（ｃｏｍｐａｃｔ）形状
コンパクトな形状の例は、概して球形の粒子、楕円体の形状の粒子、または顆粒状の粒子である。]
[0185] ”コンパクト”とは、概して細長くない形状を意味する。言い換えると、”コンパクト”な形状は、概して細長くない（ｎｏｎ−ｅｌｏｎｇａｔｅ）もしくは伸長していない（ｕｎｅｘｔｅｎｄｅｄ）のもの、すなわちいずれの寸法においても伸長していないものである。コンパクトな形状は、概して広がって（ｓｐｒｅａｄ）いないもの、または長く（ｌｏｎｇ）ない、もしくは紡錘形（ｓｐｉｎｄｌｙ）でないものであってもよい。したがって、そのような”コンパクトな形状”は一般に、概して類似する可能性のある、または大きな相異がない、直線寸法をもつ。]
[0186] したがって、コンパクトな形状のいずれか２つの寸法の比率は、５：１以下、たとえば４：１以下、たとえば３：１、２．５：１、２．４：１、２．３：１、２．２：１、２．１：１、２：１、１．９：１、１．８：１、１．７：１、１．６：１、１．５：１、１．４：１、１．３：１、１．２：１、１．１：１以下であってもよい。たとえば、２対の寸法が５：１以上の比率をもつことはできない。]
[0187] ある態様において、コンパクトな形状の最長寸法はコンパクトな形状の最短寸法より５倍未満である。他の態様において、コンパクトな形状の最長寸法は最短寸法より有意に大きくはない；すなわちその形状は比較的均一である。]
[0188] 本明細書中で用いる用語”最長寸法”は、主軸、すなわち粒子を通って描くことができる最長の線を含む軸の長さを意味すると解釈すべきである。同様に、”最短寸法”は、副軸、すなわち粒子を通って描くことができる最短の線を含む軸の長さである。]
[0189] 直線寸法がほぼ等しいかまたは類似し、あるいは最長寸法−対−最短寸法の比率が５：１未満である規則的な形状は、本明細書に記載するコンパクトな粒子に含まれる。したがって、前記の比率は最長寸法−対−最短寸法の比率に関するものであってもよい。ある態様において、２つの寸法の比率（たとえば、最長寸法−対−最短寸法）は１．１：１未満、たとえば１：１（すなわち規則的または均一な形状）である。]
[0190] したがって、適用できる場合、粒子の長さは幅または直径の５倍未満、たとえばそれの幅または直径の４倍未満、たとえば３倍未満、たとえば２倍未満、またはそれ未満である。]
[0191] コンパクトな形状には、規則的な立体（ｓｏｌｉｄ）、球体（ｓｐｈｅｒｅ）、回転楕円体（ｓｐｈｅｒｏｉｄ）、扁平回転楕円体（ｏｂｌａｔｅ ｓｐｈｅｒｏｉｄ）、平たい回転楕円体（ｆｌａｔｔｅｎｅｄ ｓｐｈｅｒｏｉｄ）、長円体（ｅｌｌｉｐｓｏｉｄ）、立方体（ｃｕｂｅ）、錐体（ｃｏｎｅ）、円筒（ｃｙｌｉｎｄｅｒ）、または多面体（ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｎ）を含めることができる。多面体には、単純な多面体または規則的な多面体が含まれる。多面体には、たとえば六面体（ｈｅｘａｈｅｄｒｏｎ）、ホリヘドロン（ｈｏｌｙｈｅｄｒｏｎ）、直方体（ｃｕｂｏｉｄ）、三面体（ｄｅｌｔａｈｅｄｒｏｎ）、五面体（ｐｅｎｔａｈｅｄｒｏｎ）、十四面体（ｔｅｔｒａｄｅｃａｈｅｄｒｏｎ）、多面体（ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｎ）、テトラフレクサゴン（ｔｅｔｒａｆｌｅｘａ
ｇｏｎ）、偏四角面体（ｔｒａｐｅｚｏｈｅｄｒｏｎ）、切頭多面体（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｎ）、フラードーム（ｇｅｏｄｅｓｉｃ ｄｏｍｅ）、七面体（ｈｅｐｔａｈｅｄｒｏｎ）、および六十面体（ｈｅｘｅｃｏｎｔａｈｅｄｒｏｎ）が含まれる。上記の形状はいずれも、前記の定義に従った”コンパクト”なものとして使用できる。たとえば、その形状が扁平回転楕円体を含む場合、これはその回転楕円体がコンパクトであって細長くないような適切な扁平度をもつ。]
[0192] ある態様において、コンパクトな形状には、寸法が前記のものである限り、バルーン形、葉巻形、ソーセージ形、円板形、涙滴形、ボール形または楕円（ｅｌｌｉｐｔｉｃａｌ）状を含めることができる。コンパクトな形状には、球形、立方体形、直方体形、タイル状、卵形（ｏｖｏｉｄ）状、長円体（ｅｌｌｉｐｓｏｉｄ）形、円板形、セル状、ピル（ｐｉｌｌ）形、カプセル形、平らな円筒形、豆（ｂｅａｎ）形、滴形、小球（ｇｌｏｂｕｌａｒ）形、エンドウ豆（ｐｅａ）形、ペレット形なども含めることができる。]
[0193] 細長い（ｅｌｏｎｇａｔｅ）形状
粒子は概して細長い形状をもつことができる。細長い形状の例は、概してロッド形の粒子、円筒形の粒子、またはスティック形の粒子である。細長い粒子は中空繊維を含むことができる。]
[0194] ”細長い”とは、概してコンパクトではない形状を意味する。言い換えると、”細長い”形状は、概して他の方向と比較して一方向に伸長したものである。細長い形状は、広がった、長いまたは紡錘形のものであってもよい。したがって、そのような”細長い形状”は一般に、おおまかに多少とも互いに異なる直線寸法をもつ。]
[0195] したがって、細長い形状のいずれか２つの寸法の比率は、５：１以上、４：１以下、たとえば１．１：１以上、１．２：１以上、１．３：１以上、１．４：１以上、１．５：１以上、１．６：１以上、１．７：１以上、１．８：１以上、１．９：１以上、２：１以上、２．１：１以上、２．２：１以上、２．３：１以上、２．４：１以上、２．５：１以上、３：１以上、４：１以上、または５：１以上であってもよい。]
[0196] たとえば、いずれか２対の寸法が５：１以上の比率をもつことができる。したがって、ある態様において、細長い形状の最長寸法は細長い形状の最短寸法の５倍より大きい。
したがって、適用できる場合、粒子の長さは幅または直径の２倍より大きく、たとえばそれの幅または直径の３倍より大きく、たとえば４倍より大きく、たとえば５倍より大きく、または１０倍より大きい。]
[0197] 細長い、またはロッド形のマイクロキャリアは、本発明方法に使用するために特に好ましい。それらは細胞−マイクロキャリア集合体を形成するためのマトリックスをより良好に付着させることが観察された。理論により制約または拘束されるわけではないが、ロッド形マイクロキャリアの長軸は、ビーズ（球）マイクロキャリアと比較して優れた付着をもたらすと考えられる；これは、付着に利用できる大きな表面積により、撹拌に際して安定な細胞−キャリアの集合が数時間以内に可能になるためである。]
[0198] 粒子サイズ
粒子が連続成長を支持するためには、それらは細胞が粒子上で成長しうるサイズをもつことができる。粒子のサイズは、細胞が他の粒子上で成長している細胞と集合するのを可能にするものでもある。たとえば、粒子のサイズは、少なくとも１つの寸法が霊長類またはヒトの幹細胞の寸法と適合するものであることが必要である可能性がある。]
[0199] 粒子のサイズは、粒子を選択し、幹細胞を付着させて成長させ（本明細書に説明し、実
施例に詳述するように）、そして多数のパラメーターのいずれか、たとえば幹細胞の成長、生存率、生物学的特性の保持、核型などをアッセイすることにより、経験的に選択できる。]
[0200] 一例として、粒子は概して球形または顆粒状のコンパクトなマイクロキャリアを含むことができる。この場合、コンパクトなマイクロキャリアは約２０μｍ〜約２５０μｍの範囲の寸法をもつことができる。]
[0201] コンパクトなマイクロキャリアについての寸法の範囲の上限は、約２５０μｍ、約２４０μｍ 、約２３０μｍ、約２２０μｍ、約２１０μｍ、約２００μｍ、約１９０μｍ、約１８０μｍ、約１７０μｍ、約１６０μｍ、約１５０μｍ、約１４０μｍ、約１３０μｍ、約１２０μｍ、約１１０μｍ、約１００μｍ、約９０μｍ、約８０μｍ、約７０μｍ、約６０μｍ 、約５０μｍ、約４０μｍまたは約３０μｍであってよい。]
[0202] コンパクトなマイクロキャリアの寸法の範囲の下限は、約２０μｍ、約３０μｍ、４０μｍ、約５０μｍ、約６０μｍ、約７０μｍ、約８０μｍ、約９０μｍ、約１００μｍまたは約１１０μｍであってよい。]
[0203] コンパクトなマイクロキャリアは、１２０μｍ〜２０μｍ、１１０μｍ〜３０μｍ、１００μｍ〜４０μｍ、９０μｍ〜５０μｍ、８０μｍ〜４０μｍ、７０μｍ〜５０μｍまたは９０〜３０μｍ、８０〜４０μｍ、７０〜４０μｍ、７０〜３０μｍ、６０〜４０μｍ、６０〜３０μｍ、６０〜５０μｍ、５０〜４０μｍ、５０〜３０μｍ、５０〜５μｍ、５０〜１０μｍ、６０〜１０μｍ、７０〜１０μｍ、６０〜２０μｍ、７０〜２０μｍの寸法をもつことができる。]
[0204] コンパクトなマイクロキャリアは、約２０μｍ、約３０μｍ、４０μｍ、約５０μｍ、約６０μｍ、約６５μｍ、約７０μｍ、約８０μｍ、約９０μｍ、約１００μｍ、約１１０μｍまたは約１２０μｍの寸法をもつことができる。]
[0205] コンパクトなマイクロキャリアの寸法は、たとえば約６５μｍであってもよい。
寸法は、マイクロキャリアの直径であってもよい。
コンパクトな粒子は、たとえば親水性マイクロキャリア、ヒドロキシル化メタクリル系マトリックスマイクロキャリア、または誘導体化した親水性ビーズ状マイクロキャリア、たとえばＴＳＫｇｅｌ Ｔｒｅｓｙｌ−５Ｐｗ（東ソー）またはＴｏｙｏｐｅａｒｌＡＦ−Ｔｒｅｓｙｌ−６５０（東ソー）を含むことができる。]
[0206] ＴＳＫｇｅｌ Ｔｒｅｓｙｌ−５Ｐｗに関する情報は、http://www.separations.us.tosohbioscience.com/Products/HPLCColumns/ByMode/Affinity/TSKgel+Tresyl-5PW.htmに見いだすことができる。]
[0207] ＴｏｙｏｐｅａｒｌＡＦ−Ｔｒｅｓｙｌ−６５０に関する情報は、http://www.separations.us.tosohbioscience.com/Products/ProcessMedia/ByMode/AFC/ToyopearlAF-Tresyl-650.htmに見いだすことができる。]
[0208] 他の例として、粒子は、概してロッドまたは円筒の形状をもつ細長いマイクロキャリアを含むことができる。この場合、細長いマイクロキャリアは約４００μｍ〜約５０μｍの範囲の最長寸法をもつことができる。]
[0209] 細長いマイクロキャリアについての最長寸法の範囲の上限は、約２０００μｍ、約１９００μｍ、約１８００μｍ、約１７００μｍ、約１６００μｍ、約１５００μｍ、約１４
００μｍ、約１３００μｍ、約１２００μｍ、約１１００μｍ、約１０００μｍ、約９００μｍ、約８００μｍ、約７００μｍ、約６００μｍ、約５００μｍ、約４００μｍ、約３９０μｍ、約３８０μｍ、約３７０μｍ、約３６０μｍ、約３５０μｍ、約３４０μｍ、約３３０μｍ、約３２０μｍ、約３１０μｍ、約３００μｍ、約２９０μｍ、約２８０μｍ、約２７０μｍ、約２６０μｍ、約２５０μｍ、約２４０μｍ、約２３０μｍ、約２２０μｍ、約２１０μｍ、約２００μｍ、約１９０μｍ、約１８０μｍ、約１７０μｍ、約１６０μｍ、約１５０μｍ、約１４０μｍ、約１３０μｍ、約１２０μｍ、約１１０μｍ、約１００μｍ、約９０μｍ、約８０μｍ、約７０μｍ、約６０μｍまたは約５０μｍであってよい。]
[0210] 細長いマイクロキャリアについての最長寸法の範囲の下限は、約２０μｍ、約３０μｍ、約４０μｍ、約５０μｍ、約６０μｍ、約７０μｍ、約８０μｍ、約９０μｍ、約１００μｍ、約１１０μｍ、約１２０μｍ、約１３０μｍ、約１４０μｍ、約１５０μｍ、約１６０μｍ、約１７０μｍ、約１８０μｍ、約１９０μｍ、約２００μｍ、約２１０μｍ、約２２０μｍ、約２３０μｍ、約２４０μｍ、約２５０μｍ、約２６０μｍ、約２７０μｍ、約２８０μｍ、約２９０μｍ、約３００μｍ、約３１０μｍ、約３２０μｍ、約３３０μｍ、約３４０μｍ、約３５０μｍ、約３６０μｍ、約３７０μｍ、約３８０μｍまたは約３９０μｍであってよい。]
[0211] 細長いマイクロキャリアは、２０００μｍ〜２０μｍ、たとえば４００μｍ〜５０μｍ、３９０μｍ〜６０μｍ、３８０μｍ〜７０μｍ、３７０μｍ〜８０μｍ、３６０μｍ〜９０μｍ、３５０μｍ〜１００μｍ、３４０μｍ〜１１０μｍ、３３０μｍ〜１２０μｍ、３２０μｍ〜１３０μｍ、３１０μｍ〜１４０μｍ、３００μｍ〜１５０μｍ、２９０μｍ〜１６０μｍ、２８０μｍ〜１７０μｍ、２７０μｍ〜１８０μｍ、２６０μｍ〜１９０μｍ、２５０μｍ〜２００μｍ、２４０μｍ〜２１０μｍまたは２３０μｍ〜２２０μｍの最長寸法をもつことができる。]
[0212] 細長いマイクロキャリアの最長寸法は、たとえば約１９０μｍ、２００μｍ、２１０μｍ、２２０μｍなどであってもよい。
細長いマイクロキャリアは、１０μｍ〜５０μｍの範囲の最短寸法をもつことができる。細長いマイクロキャリアは、約１０μｍ、約１５μｍ、約２０μｍ、約２５μｍ、約３０μｍ、約３５μｍ、約４０μｍまたは約４５μｍの最短寸法をもつことができる。]
[0213] 細長いマイクロキャリアは、ほぼ円形または長円形の断面をもつ円筒形またはロッド形であってもよく、その最短寸法は約５μｍ〜約５０μｍの範囲、たとえば約１０μｍ、約１５μｍ、約２０μｍ、約２５μｍ、約３０μｍ、約３５μｍ、約４０μｍ、または約４５μｍのいずれかであってもよい。直径が約５μｍ〜２０μｍ、約１０μｍ〜２５μｍ、約１５μｍ〜３０μｍ、約２０μｍ〜３５μｍ、約２５μｍ〜４０μｍ、約３０μｍ〜４５μｍ、約３５μｍ〜５０μｍのいずれかの範囲であってもよい。]
[0214] 細長い粒子は、たとえばセルロース円筒形マイクロキャリア、たとえばＤＥ−５２（Ｗｈａｔｍａｎ）、ＤＥ−５３（Ｗｈａｔｍａｎ）またはＱＡ−５２（Ｗｈａｔｍａｎ）を含むことができる。]
[0215] いずれか特定のマイクロキャリアのサイズおよび寸法は、バッチ内またはバッチ間で異なってもよい。たとえばＤＥ−５３ロッド形セルロースマイクロキャリアについて、本発明者らはバッチ内のキャリアの長さおよび寸法を測定し、キャリアの長さは５０〜２５０μｍ（平均長さ１３０±５０μｍ）の可能性があり、キャリアの直径は１７μｍと少なくとも５０μｍの間（平均直径３５±７μｍ）の可能性があることが分かった。]
[0216] 粒子は多孔質であってもよい。多孔質粒子は培地が成長領域の内部を通って循環するのを可能にし、これは細胞の成長を助成することができる。たとえば、粒子はマクロ多孔質またはミクロ多孔質ｃａｒｂｏｓｅｅｄマイクロキャリアを含むことができる。粒子はＳＭ１０１０（Ｂｌｕｅ Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ）またはＳＨ１０１０（Ｂｌｕｅ Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ）を含むことができる。]
[0217] 幹細胞の培養
いずれか適切な幹細胞培養方法、たとえば実施例に述べる方法を、本明細書に記載する方法および組成物に使用できる。]
[0218] いずれか適切な容器を、本明細書に記載する方法および組成物により幹細胞を伝播させるために使用できる。適切な容器には、米国特許公開ＵＳ２００７／０２６４７１３（Ｔｅｒｓｔｅｇｇｅ）に記載されたものが含まれる。]
[0219] 容器には、たとえばバイオリアクターおよびスピナーを含めることができる。本明細書中で用いる”バイオリアクター”は、真核細胞、たとえば動物細胞または哺乳動物細胞を、たとえば大規模で培養するのに適切な容器である。調節型バイオリアクターの一般的な培養体積は２０ｍｌ〜５００ｍｌである。]

权利要求:

請求項1
幹細胞をインビトロで懸濁培養において培養する方法であって、（ｉ）幹細胞を複数のマイクロキャリアに付着させてマイクロキャリア幹細胞複合体を形成し、その際、マイクロキャリアの表面はマトリックス中にコートされており；（ｉｉ）マイクロキャリア幹細胞複合体を懸濁培養において培養し；（ｉｉｉ）（ｉｉ）からの培養細胞を継代し；そして（ｉｖ）工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）を通して少なくとも３継代反復することを含み、その際、工程（ｉｖ）の後の培養物中の幹細胞が多分化能性である方法。
請求項2
幹細胞が胚性幹細胞または誘導された多分化能性幹細胞である、請求項１に記載の方法。
請求項3
幹細胞が霊長類またはヒトのものである、請求項１または２に記載の方法。
請求項4
工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）を通して少なくとも５継代、または少なくとも７継代、または少なくとも１０継代反復する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
請求項5
マイクロキャリアがロッド形である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
請求項6
マトリックスが細胞外マトリックス成分を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
請求項7
マトリックスが、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ヒアルロン酸、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、コラーゲン、エラスチン、ヘパラン硫酸、デキストラン、デキストラン硫酸、コンドロイチン硫酸のうち１以上を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
請求項8
マトリックスが、ラミニン、Ｉ型コラーゲン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、およびエンタクチン１の混合物を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
請求項9
マイクロキャリアが、セルロース、デキストラン、ヒドロキシル化メタクリレート、コラーゲン、ゼラチン、ポリスチレン、プラスチック、ガラス、セラミック、シリコーンのうち１以上を含むか、あるいはそれらからなる、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
請求項10
マイクロキャリアがマクロ多孔質またはミクロ多孔質のｃａｒｂｏｓｅｅｄマイクロキャリアである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
請求項11
マイクロキャリアがプロタミンまたはポリリジンとカップリングしている、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
請求項12
マイクロキャリアが陽電荷を有する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
請求項13
マイクロキャリアが表面陽電荷を有する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
請求項14
マイクロキャリアが親水性である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
請求項15
マイクロキャリアが実質的に球形の形状を有する、請求項１〜４または６〜１４のいずれか１項に記載の方法。
請求項16
工程（ｉｉ）において、培養物中の幹細胞の数を拡張させるのに十分な期間、幹細胞を培養する、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
請求項17
各反復サイクルにおいて、工程（ｉ）の幹細胞がその前の反復サイクルの工程（ｉｉｉ）の継代細胞から得られる、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
請求項18
工程（ｉｖ）において、工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）を通して少なくとも４継代、少なくとも５継代、少なくとも６継代、少なくとも７継代、少なくとも８継代、少なくとも９継代、少なくとも１０継代、少なくとも１１継代、少なくとも１２継代、少なくとも１３継代、少なくとも１４継代、少なくとも１５継代、少なくとも１６継代、少なくとも１７継代、少なくとも１８継代、少なくとも１９継代、少なくとも２０継代、少なくとも２１継代、少なくとも２２継代、少なくとも２３継代、少なくとも２４継代、少なくとも２５継代、少なくとも３０継代、少なくとも４０継代、少なくとも５０継代、少なくとも６０継代、少なくとも７０継代、少なくとも８０継代、少なくとも９０継代、少なくとも１００継代のいずれか反復する、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
請求項19
工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）のサイクルの少なくとも６０％について、マイクロキャリアがマトリックス中にコートされている、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
請求項20
工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）のサイクルにおいて、マイクロキャリアが同一マトリックス中にコートされている、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
請求項21
工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）の第１と第２の連続サイクルにおいて、マトリックスが異なるか、または存在しない、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
請求項22
工程（ｉｖ）の後、培養物中の少なくとも６０％の幹細胞が多分化能性である、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
請求項23
工程（ｉｖ）の後、培養物中の少なくとも６０％の幹細胞が、Ｏｃｔ４、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ−１−６０およびＭａｂ８４のうち１、２、３またはすべてを発現する、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
請求項24
該方法が、幹細胞を無血清培地、または幹細胞用馴化培地、またはフィーダー細胞を含まない状態で培養することを含む、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
請求項25
フィーダー細胞もマイクロキャリアに付着している、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
請求項26
培養がさらに、幹細胞が付着するマイクロキャリアとは異なるマイクロキャリアに付着したフィーダー細胞を含む、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
請求項27
請求項１〜２６のいずれか１項に記載の方法により得られる多分化能性幹細胞。
請求項28
さらに、工程（ｉｖ）の後に得られる幹細胞の分化を誘導する工程を含む、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
請求項29
該方法が、幹細胞の分化を誘導する条件下にマイクロキャリア幹細胞複合体を置くことを含む、請求項２８に記載の方法。
請求項30
該方法が、工程（ｉｖ）の後に、幹細胞をマイクロキャリアから分離し、そして分離した幹細胞をマイクロキャリアの無い培養において、幹細胞の分化を誘導する条件下で培養する工程を含む、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
請求項31
さらに、多分化能性幹細胞の分化を含む方法であって、（ｖ）工程（ｉｖ）の後に得られる多分化能性幹細胞を複数の第２マイクロキャリアに付着させてマイクロキャリア幹細胞複合体を形成し、その際、第２マイクロキャリアの表面は第２マトリックス中にコートされているか、またはコートされておらず；そして（ｖｉ）（ｖ）からのマイクロキャリア幹細胞複合体を懸濁培養において、幹細胞の分化を誘導する条件下で培養することを含む、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
請求項32
第１マトリックスと第２マトリックスが同一である、請求項３１に記載の方法。
請求項33
第１マトリックスと第２マトリックスが異なる、請求項３１に記載の方法。
請求項34
第１マイクロキャリアと第２マイクロキャリアが同一である、請求項３１〜３３のいずれか１項に記載の方法。
請求項35
第１マイクロキャリアと第２マイクロキャリアが異なる、請求項３１〜３３のいずれか１項に記載の方法。
請求項36
該方法がさらに、（ｖｉｉ）工程（ｖｉ）から得られる分化した幹細胞を複数の第３マイクロキャリアに付着させてマイクロキャリア幹細胞複合体を形成し、その際、第３マイクロキャリアの表面は第３マトリックス中にコートされているか、またはコートされておらず；そして（ｖｉｉｉ）（ｖｉｉ）からのマイクロキャリア幹細胞複合体を懸濁培養において、分化した幹細胞のさらなる分化を誘導する条件下で培養することを含む、請求項３１〜３５のいずれか１項に記載の方法。
請求項37
第３マトリックスが第１および第２マトリックスと異なる、請求項３６に記載の方法。
請求項38
第３マトリックスが第１および第２マトリックスのいずれか１つと同一である、請求項３６に記載の方法。
請求項39
第３マイクロキャリアが第１および第２マイクロキャリアと異なる、請求項３６〜３８のいずれか１項に記載の方法。
請求項40
第３マイクロキャリアが第１および第２マイクロキャリアの１つと同一である、請求項３６〜３８のいずれか１項に記載の方法。
請求項41
請求項２８〜４０のいずれか１項に記載の方法により得られる分化した細胞。
請求項42
分化した細胞を培養して胚様体を形成させる、請求項２８〜４０のいずれか１項に記載の方法。
請求項43
請求項４２に記載の方法により得られる胚様体。
請求項44
幹細胞をインビトロで懸濁培養において培養する方法であって、（ｉ）幹細胞を複数のマイクロキャリアに付着させてマイクロキャリア幹細胞複合体を形成し、その際、マイクロキャリアの表面はＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）中にコートされており；（ｉｉ）マイクロキャリア幹細胞複合体を懸濁培養において培養し；（ｉｉｉ）（ｉｉ）からの培養細胞を継代し；そして（ｉｖ）工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）を通して少なくとも７継代反復することを含み、その際、工程（ｉｖ）の後の培養物中の幹細胞が多分化能性であり、培養物がフィーダー細胞を含まず、各継代間で幹細胞の数が拡張し、幹細胞がヒトもしくは霊長類の胚性幹細胞またはヒトもしくは霊長類の誘導された多分化能性幹細胞である方法。
請求項45
幹細胞をインビトロで培養し、かつ分化させる方法であって、（ｉ）幹細胞を複数の第１マイクロキャリアに付着させてマイクロキャリア幹細胞複合体を形成し、その際、第１マイクロキャリアの表面は第１マトリックス中にコートされており；（ｉｉ）マイクロキャリア幹細胞複合体を懸濁培養において培養し；（ｉｉｉ）（ｉｉ）からの培養細胞を継代し；そして（ｉｖ）工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）を通して少なくとも３継代反復することを含み、その際、工程（ｉｖ）の後の培養物中の幹細胞が多分化能性であり、該方法がさらに、（ｖ）工程（ｉｖ）の後に得られる多分化能性幹細胞を複数の第２マイクロキャリアに付着させてマイクロキャリア幹細胞複合体を形成し、その際、第２マイクロキャリアの表面は第２マトリックス中にコートされているか、またはコートされておらず；そして（ｖｉ）（ｖ）からのマイクロキャリア幹細胞複合体を懸濁培養において、幹細胞の分化を誘導する条件下で培養することを含む方法。
請求項46
幹細胞が胚性幹細胞または誘導された多分化能性幹細胞である、請求項４５に記載の方法。
請求項47
幹細胞が霊長類またはヒトのものである、請求項４５または４６に記載の方法。
請求項48
マイクロキャリアがロッド形である、請求項４５〜４７のいずれか１項に記載の方法。
請求項49
第１マトリックスと第２マトリックスが同一である、請求項４５〜４８のいずれか１項に記載の方法。
請求項50
第１マトリックスと第２マトリックスが異なる、請求項４５〜４８のいずれか１項に記載の方法。
請求項51
第１マイクロキャリアと第２マイクロキャリアが同一である、請求項４５〜５０のいずれか１項に記載の方法。
請求項52
第１マイクロキャリアと第２マイクロキャリアが異なる、請求項４５〜５０のいずれか１項に記載の方法。
請求項53
該方法がさらに、（ｖｉｉ）工程（ｖｉ）から得られる分化した幹細胞を複数の第３マイクロキャリアに付着させてマイクロキャリア幹細胞複合体を形成し、その際、第３マイクロキャリアの表面は第３マトリックス中にコートされているか、またはコートされておらず；そして（ｖｉｉｉ）（ｖｉｉ）からのマイクロキャリア幹細胞複合体を懸濁培養において、分化した幹細胞のさらなる分化を誘導する条件下で培養することを含む、請求項４５〜５２のいずれか１項に記載の方法。
請求項54
第３マトリックスが第１および第２マトリックスと異なる、請求項５３に記載の方法。
請求項55
第３マトリックスが第１および第２マトリックスの１つと同一である、請求項５３に記載の方法。
請求項56
第３マイクロキャリアが第１および第２マイクロキャリアと異なる、請求項５３〜５５のいずれか１項に記載の方法。
請求項57
第３マイクロキャリアが第１および第２マイクロキャリアの１つと同一である、請求項５３〜５５のいずれか１項に記載の方法。
請求項58
幹細胞をインビトロで分化させる方法であって、多分化能性幹細胞を複数のマイクロキャリアに付着させてマイクロキャリア幹細胞複合体を形成し、その際、マイクロキャリアの表面はマトリックス中にコートされているか、またはコートされておらず、そしてマイクロキャリア幹細胞複合体を懸濁培養において、幹細胞の分化を誘導する条件下で培養することを含む方法。
請求項59
幹細胞が胚性幹細胞または誘導された多分化能性幹細胞である、請求項５８に記載の方法。
請求項60
幹細胞が霊長類またはヒトのものである、請求項５８または５９に記載の方法。
請求項61
マイクロキャリアがロッド形である、請求項５８〜６０のいずれか１項に記載の方法。
請求項62
マトリックスが細胞外マトリックス成分を含む、請求項５８〜６１のいずれか１項に記載の方法。
請求項63
マトリックスが、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ヒアルロン酸、コラーゲン、エラスチン、ヘパラン硫酸、デキストラン、デキストラン硫酸、コンドロイチン硫酸のうち１以上を含む、請求項５８〜６１のいずれか１項に記載の方法。
請求項64
マトリックスが、ラミニン、Ｉ型コラーゲン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、およびエンタクチン１の混合物を含む、請求項５８〜６１のいずれか１項に記載の方法。
請求項65
マイクロキャリアが、セルロース、デキストラン、ヒドロキシル化メタクリレート、コラーゲン、ゼラチン、ポリスチレン、プラスチック、ガラス、セラミック、シリコーンのうち１以上を含むか、あるいはそれらからなる、請求項５８〜６４のいずれか１項に記載の方法。
請求項66
マイクロキャリアがマクロ多孔質またはミクロ多孔質のｃａｒｂｏｓｅｅｄマイクロキャリアである、請求項５８〜６４のいずれか１項に記載の方法。
請求項67
マイクロキャリアがプロタミンまたはポリリジンとカップリングしている、請求項５８〜６６のいずれか１項に記載の方法。
請求項68
マイクロキャリアが陽電荷を有する、請求項５８〜６７のいずれか１項に記載の方法。
請求項69
マイクロキャリアが表面陽電荷を有する、請求項５８〜６８のいずれか１項に記載の方法。
請求項70
マイクロキャリアが親水性である、請求項５８〜６９のいずれか１項に記載の方法。
請求項71
マイクロキャリアが実質的に球形の形状を有する、請求項５８〜６０または６２〜７０のいずれか１項に記載の方法。
請求項72
多能性幹細胞をインビトロで懸濁培養において培養する方法であって、（ｉ）多能性幹細胞を複数のマイクロキャリアに付着させてマイクロキャリア幹細胞複合体を形成し；（ｉｉ）マイクロキャリア幹細胞複合体を懸濁培養において培養することを含み、その際、工程（ｉｉ）の後の培養物中の幹細胞が多能性である方法。
請求項73
工程（ｉ）においてマイクロキャリアの表面がマトリックス中にコートされている、請求項７２に記載の方法。
請求項74
さらに、工程（ｉｉ）の後に得られる幹細胞の分化を誘導する工程を含む、請求項７２または７３に記載の方法。
請求項75
該方法が、幹細胞の分化を誘導する条件下にマイクロキャリア幹細胞複合体を置くことを含む、請求項７４に記載の方法。
請求項76
該方法が、工程（ｉｉ）の後に、幹細胞をマイクロキャリアから分離し、そして分離した幹細胞をマイクロキャリアの無い培養において、幹細胞の分化を誘導する条件下で培養する工程を含む、請求項７２〜７５のいずれか１項に記載の方法。
請求項77
多能性幹細胞をインビトロで懸濁培養において培養する方法であって、（ｉ）多能性幹細胞を複数のマイクロキャリアに付着させてマイクロキャリア幹細胞複合体を形成し；（ｉｉ）マイクロキャリア幹細胞複合体を懸濁培養において培養し；（ｉｉｉ）（ｉｉ）からの培養細胞を継代し；そして（ｉｖ）工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）を通して少なくとも２継代反復することを含み、その際、工程（ｉｖ）の後の培養物中の幹細胞が多能性である方法。
請求項78
工程（ｉ）においてマイクロキャリアの表面がマトリックス中にコートされている、請求項７７に記載の方法。
請求項79
請求項７２、７３、７７または７８のいずれか１項に記載の方法により得られる多能性幹細胞。
請求項80
さらに、工程（ｉｖ）の後に得られる幹細胞の分化を誘導する工程を含む、請求項７７または７８のいずれか１項に記載の方法。
請求項81
該方法が、幹細胞の分化を誘導する条件下にマイクロキャリア幹細胞複合体を置くことを含む、請求項８０に記載の方法。
請求項82
該方法が、工程（ｉｖ）の後に、幹細胞をマイクロキャリアから分離し、そして分離した幹細胞をマイクロキャリアの無い培養において、幹細胞の分化を誘導する条件下で培養する工程を含む、請求項７７〜８１のいずれか１項に記載の方法。
請求項83
さらに、多能性幹細胞の分化を含む方法であって、（ｖ）工程（ｉｖ）の後に得られる多能性幹細胞を複数の第２マイクロキャリアに付着させてマイクロキャリア幹細胞複合体を形成し、その際、第２マイクロキャリアの表面は第２マトリックス中にコートされているか、またはコートされておらず；そして（ｖｉ）（ｖ）からのマイクロキャリア幹細胞複合体を懸濁培養において、幹細胞の分化を誘導する条件下で培養することを含む、請求項７７に記載の方法。
請求項84
請求項７４〜８３のいずれか１項に記載の方法により得られる分化した細胞。
請求項85
多能性幹細胞をインビトロで培養し、かつ分化させる方法であって、（ｉ）幹細胞を複数の第１マイクロキャリアに付着させてマイクロキャリア幹細胞複合体を形成し；（ｉｉ）マイクロキャリア幹細胞複合体を懸濁培養において培養し；（ｉｉｉ）（ｉｉ）からの培養細胞を継代し；そして（ｉｖ）工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）を通して少なくとも２継代反復することを含み、その際、工程（ｉｖ）の後の培養物中の幹細胞が多能性であり、該方法がさらに、（ｖ）工程（ｉｖ）の後に得られる多能性幹細胞を複数の第２マイクロキャリアに付着させてマイクロキャリア幹細胞複合体を形成し、その際、第２マイクロキャリアの表面は第２マトリックス中にコートされているか、またはコートされておらず；そして（ｖｉ）（ｖ）からのマイクロキャリア幹細胞複合体を懸濁培養において、幹細胞の分化を誘導する条件下で培養することを含む方法。
請求項86
工程（ｉ）においてマイクロキャリアの表面が第１マトリックス中にコートされている、請求項８５に記載の方法。
請求項87
幹細胞をインビトロで分化させる方法であって、多能性幹細胞を複数のマイクロキャリアに付着させてマイクロキャリア幹細胞複合体を形成し、その際、マイクロキャリアの表面は第２マトリックス中にコートされているか、またはコートされておらず、そしてマイクロキャリア幹細胞複合体を懸濁培養において、幹細胞の分化を誘導する条件下で培養することを含む方法。
請求項88
幹細胞が成体幹細胞、または多分化能性幹細胞に由来する多能性幹細胞である、請求項７２〜８７のいずれか１項に記載の方法。
請求項89
マイクロキャリアがロッド形である、請求項７２〜８８のいずれか１項に記載の方法。
請求項90
マトリックスが細胞外マトリックス成分を含む、請求項７２〜８９のいずれか１項に記載の方法。
請求項91
マトリックスが、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ヒアルロン酸、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、コラーゲン、エラスチン、ヘパラン硫酸、デキストラン、デキストラン硫酸、コンドロイチン硫酸のうち１以上を含む、請求項７２〜８９のいずれか１項に記載の方法。
請求項92
マトリックスが、ラミニン、Ｉ型コラーゲン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、およびエンタクチン１の混合物を含む、請求項７２〜８９のいずれか１項に記載の方法。
請求項93
マイクロキャリアが、セルロース、デキストラン、ヒドロキシル化メタクリレート、コラーゲン、ゼラチン、ポリスチレン、プラスチック、ガラス、セラミック、シリコーンのうち１以上を含むか、あるいはそれらからなる、請求項７２〜９２のいずれか１項に記載の方法。
請求項94
マイクロキャリアがマクロ多孔質またはミクロ多孔質のｃａｒｂｏｓｅｅｄマイクロキャリアである、請求項７２〜９２のいずれか１項に記載の方法。
請求項95
マイクロキャリアが陽電荷を有する、請求項７２〜９４のいずれか１項に記載の方法。
請求項96
マイクロキャリアが表面陽電荷を有する、請求項７２〜９５のいずれか１項に記載の方法。
請求項97
工程（ｉｉ）において、培養物中の幹細胞の数を拡張させるのに十分な期間、幹細胞を培養する、請求項７２〜９６のいずれか１項に記載の方法。
請求項98
各反復サイクルにおいて、工程（ｉ）の幹細胞がその前の反復サイクルの工程（ｉｉｉ）の継代細胞から得られる、請求項７７〜９７のいずれか１項に記載の方法。
請求項99
工程（ｉｖ）において、工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）を通して少なくとも３継代、少なくとも４継代、少なくとも５継代、少なくとも６継代、少なくとも７継代、少なくとも８継代、少なくとも９継代、少なくとも１０継代、少なくとも１１継代、少なくとも１２継代、少なくとも１３継代、少なくとも１４継代、少なくとも１５継代、少なくとも１６継代、少なくとも１７継代、少なくとも１８継代、少なくとも１９継代、少なくとも２０継代、少なくとも２１継代、少なくとも２２継代、少なくとも２３継代、少なくとも２４継代、少なくとも２５継代、少なくとも３０継代、少なくとも４０継代、少なくとも５０継代、少なくとも６０継代、少なくとも７０継代、少なくとも８０継代、少なくとも９０継代、少なくとも１００継代のいずれか反復する、請求項７７〜９８のいずれか１項に記載の方法。
請求項100
霊長類またはヒトの幹細胞の伝播および／または分化のための、マトリックス中にコートされたマイクロキャリアの使用であって、マイクロキャリアがＤＥ−５２（Ｗｈａｔｍａｎ）、ＤＥ−５３（Ｗｈａｔｍａｎ）、ＱＡ−５２（Ｗｈａｔｍａｎ）、ＴＳＫｇｅｌＴｒｅｓｙｌ−５Ｐｗ（東ソー）またはＴｏｙｏｐｅａｒｌＡＦ−Ｔｒｅｓｙｌ−６５０（東ソー）、ＳＭ１０１０（ＢｌｕｅＭｅｍｂｒａｎｅｓ）およびＳＨ１０１０（ＢｌｕｅＭｅｍｂｒａｎｅｓ）から選択される使用。
請求項101
マトリックスが、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ヒアルロン酸、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、コラーゲン、エラスチン、ヘパラン硫酸、デキストラン、デキストラン硫酸、コンドロイチン硫酸のうち１以上を含む、請求項１００に記載の使用。
請求項102
マトリックスが、ラミニン、Ｉ型コラーゲン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、およびエンタクチン１の混合物を含む、請求項１００に記載の使用。
請求項103
多分化能性細胞または多能性細胞をインビトロ懸濁培養において成長および／または分化させる際に使用するのに適切なマイクロキャリアであって、マイクロキャリアがセルロース、デキストラン、ヒドロキシル化メタクリレート、またはコラーゲンのうち１以上を含み、マイクロキャリアが細長い形状を有し、約２０００μｍ未満の最長寸法および約１０μｍより大きい最短寸法を有し、マイクロキャリアの表面がマトリックス中にコートされ、１個または複数の多分化能性細胞または多能性細胞がマトリックスコーティングに付着しているマイクロキャリア。
請求項104
マイクロキャリアがロッド形である、請求項１０３に記載のマイクロキャリア。
請求項105
マトリックスコーティングが、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ヒアルロン酸、ラミニンまたはフィブロネクチンのうち１以上を含む、請求項１０３または１０４に記載のマイクロキャリア。
請求項106
細胞が多分化能性細胞である、請求項１０３〜１０５のいずれか１項に記載のマイクロキャリア。
請求項107
多分化能性細胞が霊長類もしくはヒトの胚性幹細胞または誘導された多分化能性幹細胞である、請求項１０３〜１０６のいずれか１項に記載のマイクロキャリア。
請求項108
マイクロキャリアが陽電荷を有する、請求項１０３〜１０７のいずれか１項に記載のマイクロキャリア。
請求項109
マイクロキャリアが表面陽電荷を有する、請求項１０３〜１０８のいずれか１項に記載のマイクロキャリア。
請求項110
５０μｍ〜４００μｍの最長寸法を有する、請求項１０３〜１０９のいずれか１項に記載のマイクロキャリア。
請求項111
それに多分化能性細胞または多能性細胞が付着したそれぞれ請求項１０３〜１１０のいずれか１項に記載の２以上のマイクロキャリアを含む、集合体。
請求項112
多分化能性または多能性の状態を有する新たな細胞を生成するための多分化能性細胞または多能性細胞のインビトロでの培養における、請求項１０３〜１１０のいずれか１項に記載のマイクロキャリアの使用。
請求項113
多分化能性細胞または多能性細胞のインビトロ分化における、請求項１０３〜１１０のいずれか１項に記載のマイクロキャリアの使用。
請求項114
多分化能性細胞または多能性細胞をインビトロで培養して多分化能性または多能性の状態を有する新たな細胞を生成する方法であって、多分化能性または多能性の状態を有する新たな細胞を生成するのに適切な条件下で請求項１０３〜１１０のいずれか１項に記載のマイクロキャリアを培養することを含む方法。
請求項115
多分化能性細胞または多能性細胞をインビトロで分化させる方法であって、多分化能性細胞または多能性細胞の分化を誘導する条件下で請求項１０３〜１１０のいずれか１項に記載のマイクロキャリアを培養することを含む方法。